在这里,我们描述了一种用于微调空间组学技术感兴趣区域(ROI)的协议,以更好地表征肿瘤微环境并识别特定的细胞群。对于蛋白质组学测定,自动定制方案可以指导ROI选择,而转录组学测定可以利用小至50μm的ROI进行微调。
多路复用可以评估同一组织上的多个标记物,同时提供空间背景。空间组学技术分别利用可光切割的寡核苷酸标记抗体和探针,实现蛋白质和RNA多重检测。从组织中的特定区域切割和定量寡核苷酸,以阐明潜在的生物学。在这里,该研究表明,自动化定制抗体可视化方案可用于结合空间蛋白质组学测定来指导ROI选择。这种特定方法在空间转录组学测定中没有显示出可接受的性能。该协议描述了在自动化平台上开发用于标记物可视化的 3 重免疫荧光 (IF) 测定,使用 tyramide 信号放大 (TSA) 来扩增来自给定蛋白质靶标的荧光信号并增加抗体库以供选择。使用经过全面验证的 3 重检测自动可视化方案,以确保质量和可重复性。此外,还评估了DAPI与SYTO染料的交换,以允许在空间分析平台上对基于TSA的IF测定进行成像。此外,我们测试了使用空间转录组学测定选择小ROI的能力,以允许研究高度特异性的兴趣区域(例如,为给定细胞类型富集的区域)。收集直径为50μm和300μm的ROI,分别对应于约15个细胞和100个细胞。将样品制成文库并进行测序,以研究检测来自小ROI和组织轮廓特定区域的信号的能力。我们确定空间蛋白质组学技术极大地受益于自动化的标准化方案,以指导ROI选择。虽然这种自动化可视化方案与空间转录组学测定不兼容,但我们能够测试并确认,使用标准的手动可视化方案即使在很小的ROI中也可以成功检测到特定的细胞群。
多重检测技术的进步继续为肿瘤中存在的靶标提供更好的表征工具。肿瘤微环境(TME)是一个由肿瘤细胞、浸润免疫细胞和基质组成的复杂系统,其中空间信息对于更好地理解和解释感兴趣的生物标志物之间的相互作用机制至关重要1。借助GeoMx数字空间剖面仪(DSP)和10x Visium等新兴技术,可以在其空间环境中同时检测和量化多个目标。使用促进组织可视化的免疫荧光方案可以进一步提高这些技术的空间分析能力。
我们专注于该方法开发的空间组学技术包括空间蛋白质组学和转录组学测定,其中寡核苷酸通过紫外敏感光裂解接头连接到抗体或RNA探针上。用这些寡核偶联抗体或探针标记组织学载玻片,然后在空间分析平台上成像。接下来,选择不同大小和形状的ROI进行照明,并将光裂解的寡核苷酸吸出并收集在96孔板中。制备光裂解寡核苷酸,以使用纳米弦nCounter系统或下一代测序(NGS)2,3(图1)4,5进行定量。
组织内的细胞分布各不相同,使用选定的标记物和不同的ROI大小表征细胞特定位置的能力对于充分了解组织环境和识别特定特征非常重要。在这里提到的空间组学技术中,标准可视化方案使用直接偶联抗体,是一种手动方案。区分肿瘤和基质的标准标志物是泛细胞角蛋白(panCK)和CD456,7,但需要额外的标志物来靶向感兴趣的特定细胞群。此外,使用直接偶联的荧光抗体缺乏扩增,这限制了抗体选择丰富的标记物。此外,手动检测比自动化工作流程更容易变化8。因此,希望有一个可定制、自动化和放大的可视化协议来选择投资回报率。
在这里,该研究表明,对于空间蛋白质组学测定,TSA技术可用于自动化平台上的可视化协议,从而实现更具针对性和标准化的测定。此外,基于TSA的检测允许使用低表达标记物,从而扩大了可以选择用于可视化的靶标范围。使用自动化平台开发了针对panCK,FAP和抗体X的3重测定,其中panCK和FAP分别用于区分肿瘤和基质。抗体X是肿瘤中经常遇到的基质蛋白,但其生物学和对抗肿瘤免疫的影响尚不完全清楚。在富含抗体X的区域表征免疫质地可以阐明其在抗肿瘤免疫和治疗反应中的作用,以及其作为药物靶标的潜力。
虽然定制的自动化TSA可视化组合被证明在空间蛋白质组学测定中是成功的,但无法确认这些测定在空间转录组学测定中的应用。这很可能是由于用于自动可视化方案的试剂和方案,这似乎损害了RNA的完整性。认识到可视化标记物的自动标记方案可用于空间蛋白质组学测定,但不能用于空间转录组学测定,这为空间组学技术测定设计提供了重要指导。
此外,该研究表明,空间转录组学测定可用于分析直径小至50μm或约15个细胞的区域的靶标。选择两种不同大小的ROI来测试该测定在小ROI中检测转录本的能力。对于每个感兴趣的区域,收集对应于1,800个mRNA靶标的寡核苷酸,并根据空间分析平台协议将其制成文库。对文库进行单独索引,随后进行合并和排序。这允许评估池化效率和在小ROI中识别特定细胞群的能力。
本文表明,对于空间蛋白质组学测定,可以使用一种自动化协议来指导对感兴趣的特定标记物进行ROI选择,以选择性地靶向相关组织区域的询问并表征组织的空间环境。此外,我们证明较小的ROI可用于空间转录组学测定,以检测和表征特定的细胞群。
迄今为止,手动方案中的直接偶联荧光抗体最常用作空间蛋白质组学或空间转录组学测定的可视化面板9,10。然而,对于丰度较低的标志物,使用直接偶联的荧光抗体可能具有挑战性,从而限制了合适抗体的选择。该协议表明,可视化标记物的标记可以在使用TSA技术的自动染色平台上自动进行,以支持空间蛋白质组学测定。这为可视化面板的定制提供?…
The authors have nothing to disclose.
作者承认Thomas Wu处理NGS文件。我们感谢James Ziai的结果讨论和稿件审查,以及Meredith Triplet和Rachel Taylor的内部稿件修订。
10x Tris buffered saline (TBS) | Cell Signaling Technologies | 12498S | Diluted to 1x TBS in DEPC treated water |
Antibody X (not disclosed) | antibody blinded due to confidentiality | ||
DEPC-treated water | ThermoFisher | AM9922 | Another can be used |
DISCOVERY Cell Conditioning ( CC1) | Ventana | 950-500 | |
DISCOVERY Cy5 Kit | Ventana | 760-238 | Referred as Cy5 |
DISCOVERY FAM Kit | Ventana | 760-243 | Referred as FAM |
DISCOVERY Goat Ig Block | Ventana | 760-6008 | Referred as Gt Ig Block |
DISCOVERY OmniMap anti-Ms HRP | Ventana | 760-4310 | Referred as OMap anti-Ms HRP |
DISCOVERY OmniMap anti-Rb HRP | Ventana | 760-4311 | Referred as OMap anti-Rb HRP |
DISCOVERY Rhodamine 6G Kit | Ventana | 760-244 | Referred as Rhodamine 6G |
DISCOVERY ULTRA Automated Slide Preparation System | Ventana | 05 987 750 001 / N750-DISU-FS | Referred as autostainer on the manuscript |
FAP [EPR20021] Antibody | Abcam | Ab207178 | |
GeoMx Digital Spatial Profiler | NanoString | GMX-DSP-1Y | Referred as spatial profiling platform on the manuscript |
Humidity chamber | Simport | M920-2 | Another can be used |
Pan-Cytokeratin [AE1/AE3] Antibody | Abcam | Ab27988 | |
ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36934 | |
Python | Python | Statistical analysis | |
Reaction Buffer (10x) | Ventana | 950-300 | |
Statistical analysis software | GraphPad | Prism 7 | Statistical analysis |
SYTO 64 | ThermoFisher | S11346 | |
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) | Ventana | 950-223 | |
Ventana Antibody Diluent with Casein | Ventana | 760-219 | Referred as specified diluent on the manuscript |
Ventana Primary antibody dispenser | Ventana | Catalog number depends on dispenser number |