インフルエンザ菌に対する呼吸器免疫応答の評価
Summary
インフルエンザ 菌は気道に炎症を誘発します。この記事では、フローサイトメトリーと共焦点顕微鏡を使用して、この細菌に応答する食細胞とリンパ球による免疫応答を定義することに焦点を当てます。
Abstract
インフルエンザ菌 (Hi)は、さまざまな呼吸器疾患に見られる一般的な細菌です。この細菌に対する呼吸器免疫/炎症反応を評価するために、さまざまな異なるアッセイ/技術を使用できます。フローサイトメトリーと共焦点顕微鏡は、生物学的反応の詳細な特性評価を可能にする蛍光ベースの技術です。細胞壁成分、死滅/不活化製剤、生菌など、さまざまな形態のHi抗原を使用できます。Hiは、濃縮培地を必要とする潔癖な細菌ですが、一般的に標準的な実験室の設定では増殖しやすいです。Hiによる刺激のための組織サンプルは、末梢血、気管支鏡検査、または切除された肺から得ることができる(例えば、肺癌の治療のための手術を受けている患者において)。マクロファージおよび好中球の機能は、食作用、活性酸素種、細胞内サイトカイン産生など、さまざまなパラメータを測定したフローサイトメトリーを使用して包括的に評価できます。リンパ球機能(例えば、T細胞およびNK細胞機能)は、主に細胞内サイトカイン産生について、フローサイトメトリーを用いて特異的に評価され得る。Hi感染は、好中球(NET)とマクロファージ(MET)の両方による細胞外トラップ産生の強力な誘導因子です。共焦点顕微鏡法は、NETおよびMET発現を評価するための最も最適な方法であり、プロテアーゼ活性の評価にも使用できます。 インフルエンザ 菌に対する肺免疫は、フローサイトメトリーと共焦点顕微鏡を使用して評価できます。
Introduction
インフルエンザ菌 (Hi)は、ほとんどの健康な成人の咽頭に存在する正常な共生細菌です。Hiは、多糖カプセル(タイプA〜F、例えばタイプBまたはHiB)を有するか、またはカプセルを欠いており、タイプ不可能(NTHi)1である。この細菌による粘膜のコロニー形成は幼児期に始まり、異なるコロニー形成株の代謝回転があります2。この細菌はまた、上気道と下気道の両方に侵入することができます。これに関連して、免疫応答および炎症の活性化を誘導し得る3、4。この炎症反応は臨床疾患を引き起こし、副鼻腔炎、中耳炎、気管支炎、嚢胞性線維症、肺炎、慢性閉塞性肺疾患(COPD)など、さまざまな重要な呼吸器疾患の一因となる可能性があります。これらの状態のほとんどは、NTHi株2によるものです。この記事では、フローサイトメトリーと共焦点顕微鏡を使用してHiに対する呼吸免疫応答を評価する方法について説明します。
以下に記載される方法は、Hiに対する炎症反応を評価するために改変された十分に確立された技術から適応されている。Hiの適切な抗原形態の選択は、この評価の重要な部分です。抗原製剤は、細胞壁成分から生きた細菌まで多岐にわたります。アッセイを確立して標準化するために、末梢血サンプルの使用は最初は非常に役立つかもしれません。
フローサイトメトリーは、細胞レベルで1つのサンプルからさまざまなパラメータと機能アッセイの測定を可能にします。この技術は、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)またはELISspotなどの他のより一般的な方法と比較した場合に、特定の細胞応答(例えば、活性酸素種(ROS)の産生または細胞内サイトカイン産生)を評価できるという利点を有する。
細胞外トラップは、好中球(NET)5,6,7およびマクロファージ(MET)などの他の細胞によって発現されます8。それらは、特に肺9の感染症において、重要な炎症反応としてますます認識されています。それらは共焦点蛍光顕微鏡によって評価され得る。この手法により、NET/METの決定的な同定が可能になり、その発現が他の形態の細胞死と区別されます6。
フローサイトメトリーと共焦点顕微鏡はどちらも蛍光ベースのアッセイです。それらの成功は、生物学的サンプルの最適なひずみプロトコルに依存しています。これらの方法は学習に時間がかかり、適切な監督の専門知識が必要です。関連する機器は、購入と実行の両方に費用がかかります。それらの使用に最適な設定には、主要な大学と三次紹介病院が含まれます。
このプロトコルで使用される方法は、呼吸器疾患に関与する他の同様の生物(例えば、 Moxarella catarrhalis および 肺炎連鎖球菌)の研究に転用可能である。NTHiはまた、他の一般的な呼吸器細菌とも相互作用します10。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここにリストされている方法は、Hiに対する炎症性肺応答に関する詳細な情報を得るために併用することができる蛍光ベースのフローサイトメトリーおよび共焦点顕微鏡技術を使用する。
使用するHiの適切な抗原製剤を確立することは重要であり、この点に関して微生物学者から特定の意見を得ることをお勧めします。Live Hiはより強い反応を誘発しますが、殺されたHi製?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、この作業を支援してくれたMonash Healthの臨床免疫学のスタッフに感謝したいと思います。
Materials
| Ammonium chloride | Sigma Aldrich | 213330 | |
| Brefeldin | Sigma Aldrich | B6542 | |
| CD28 | Thermofisher | 16-0289-81 | |
| CD49d | Thermofisher | 534048 | |
| DAPI prolong gold | Thermofisher | P36931 | |
| DHR123 | Sigma Aldrich | 109244-58-8 | |
| Filcon sterile nylon mesh | Becton Dickinson | 340606 | |
| Gelatin substrate, Enzchek | Molecular probes | E12055 | |
| MACS mix tube rotater | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
| Medimachine | Becton Dickinson | Catalogue number not available | |
| Medicons 50 µm | Becton Dickinson | 340592 | |
| Pansorbin | Sigma Aldrich | 507858 | |
| Propidium iodide | Sigma Aldrich | P4170 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | 8047152 | |
| Superfrost slides | Thermofisher | 11562203 |
References
- Smith-Vaughan, H. C., Sriprakash, K. S., Leach, A. J., Mathews, J. D., Kemp, D. J. Low genetic diversity of Haemophilus influenzae type b compared to nonencapsulated H. influenzae in a population in which H. influenzae is highly endemic. Infection and Immunity. 66, 3403-3409 (1998).
- Murphy, T. F. Haemophilus and Moxarella infections. Harrisons Principles of Internal Medicine. 152, (2018).
- King, P. T., Sharma, R. The lung immune response to nontypeable haemophilus influenzae (lung immunity to NTHi). Journal of Immunology Research. , 706376 (2015).
- Ahearn, C. P., Gallo, M. C., Murphy, T. F. Insights on persistent airway infection by non-typeable Haemophilus influenzae in chronic obstructive pulmonary disease. Pathogens and Disease. 75, 9 (2017).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin. Journal of Cell Biology. 198, 773-783 (2012).
- Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nature Medicine. 23, 279-287 (2017).
- Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte. Journal of Leukocyte Biology. 97, 1023-1035 (2015).
- Cheng, O. Z., Palaniyar, N. NET balancing: a problem in inflammatory lung diseases. Frontiers in Immunology. 4, 1 (2013).
- Jacobs, D. M., Ochs-Balcom, H. M., Zhao, J., Murphy, T. F., Sethi, S. Lower airway bacterial colonization patterns and species-specific interactions in chronic obstructive pulmonary disease. Journal of Clinical Microbiology. 56, (2018).
- Barenkamp, S. J., Munson, R. S., Granoff, D. M. Subtyping isolates of Haemophilus influenzae type b by outer-membrane protein profiles. The Journal of Infectious Diseases. 143, 668-676 (1981).
- Barenkamp, S. J. Outer membrane proteins and lipopolysaccharides of nontypeable Haemophilus influenzae. The Journal of Infectious Diseases. 165, 181-184 (1992).
- Johnston, J. W. Laboratory growth and maintenance of Haemophilus influenzae. Current Protocols in Microbiology. , (2010).
- King, P. T., et al. Adaptive immunity to nontypeable Haemophilus influenzae. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 167, 587-592 (2003).
- Coleman, H. N., Daines, D. A., Jarisch, J., Smith, A. L. Chemically defined media for growth of Haemophilus influenzae strains. Journal of Clinical Microbiology. 41, 4408-4410 (2003).
- King, P. T., Ngui, J., Gunawardena, D., Holmes, P. W., Farmer, M. W., Holdsworth, S. R. Systemic humoral immunity to non-typeable Haemophilus influenzae. Clinical & Experimental Immunology. 153, 376-384 (2008).
- King, P. T., et al. Nontypeable Haemophilus influenzae induces sustained lung oxidative stress and protease expression. PLoS One. 10, 0120371 (2015).
- Aaron, S. D., et al. Granulocyte inflammatory markers and airway infection during acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 163, 349-355 (2001).
- King, P. T., et al. Lung T-cell responses to nontypeable Haemophilus influenzae in patients with chronic obstructive pulmonary disease. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 131, 1314-1321 (2013).
- Tsujikawa, T., et al. Robust cell detection and segmentation for image cytometry reveal th17 cell heterogeneity. Cytometry A. 95, 389-398 (2019).
- Sharma, R., O’Sullivan, K. M., Holdsworth, S. R., Bardin, P. G., King, P. T. Visualizing macrophage extracellular traps using confocal microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56459 (2017).
- Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Maniura-Weber, K., Ren, Q. Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide. BMC Microbiology. 15, 36 (2015).
- Ueckert, J. E., Nebe von-Caron, G., Bos, A. P., ter Steeg, P. F. Flow cytometric analysis of Lactobacillus plantarum to monitor lag times, cell division and injury. Letters in Applied Microbiology. 25, 295-299 (1997).
- Essilfie, A. T., et al. Combined Haemophilus influenzae respiratory infection and allergic airways disease drives chronic infection and features of neutrophilic asthma. Thorax. 67, 588-599 (2012).
- Huvenne, W., et al. Exacerbation of cigarette smoke-induced pulmonary inflammation by Staphylococcus aureus enterotoxin B in mice. Respiratory Research. 12, 69 (2011).
- Radhakrishna, N., Farmer, M., Steinfort, D. P., King, P. A Comparison of Techniques for Optimal Performance of Bronchoalveolar Lavage. Journal of Bronchology & Interventional Pulmonology. 22, 300-305 (2015).
- Quatromoni, J. G., Singhal, S., Bhojnagarwala, P., Hancock, W. W., Albelda, S. M., Eruslanov, E. An optimized disaggregation method for human lung tumors that preserves the phenotype and function of the immune cells. Journal of Leukocyte Biology. 97, 201-209 (2015).
- Tighe, R. M., et al. Improving the quality and reproducibility of flow cytometry in the lung. An official American thoracic society workshop report. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 61, 150-161 (2019).
- Yu, Y. R., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLoS One. 11, 0150606 (2016).
- Duan, M., et al. Distinct macrophage subpopulations characterize acute infection and chronic inflammatory lung disease. Journal of Immunology. 189, 946-955 (2012).
