Beoordeling van respiratoire immuunresponsen op Haemophilus Influenzae
Summary
Haemophilus influenzae induceert ontsteking in de luchtwegen. Dit artikel zal zich richten op het gebruik van flowcytometrie en confocale microscopie om immuunresponsen door fagocyten en lymfocyten als reactie op deze bacterie te definiëren.
Abstract
Haemophilus influenzae (Hi) is een veel voorkomende bacterie die voorkomt in een reeks ademhalingsaandoeningen. Een verscheidenheid aan verschillende testen / technieken kan worden gebruikt om de respiratoire immuun / ontstekingsreactie op deze bacterie te beoordelen. Flowcytometrie en confocale microscopie zijn op fluorescentie gebaseerde technologieën die gedetailleerde karakterisering van biologische reacties mogelijk maken. Verschillende vormen van Hi-antigeen kunnen worden gebruikt, waaronder celwandcomponenten, gedode / geïnactiveerde preparaten en levende bacteriën. Hi is een kieskeurige bacterie die verrijkte media vereist, maar over het algemeen gemakkelijk te kweken is in standaard laboratoriumomgevingen. Weefselmonsters voor stimulatie met Hi kunnen worden verkregen uit perifeer bloed, bronchoscopie of gereseceerde long (bijvoorbeeld bij patiënten die een operatie ondergaan voor de behandeling van longkanker). Macrofaag en neutrofiele functie kunnen uitgebreid worden beoordeeld met behulp van flowcytometrie met een verscheidenheid aan gemeten parameters, waaronder fagocytose, reactieve zuurstofsoorten en intracellulaire cytokineproductie. De lymfocytenfunctie (bijv. T-cel- en NK-celfunctie) kan specifiek worden beoordeeld met behulp van flowcytometrie, voornamelijk voor intracellulaire cytokineproductie. Hi-infectie is een krachtige inductor van extracellulaire valproductie, zowel door neutrofielen (NET’s) als macrofagen (METs). Confocale microscopie is misschien wel de meest optimale manier om NET- en MET-expressie te beoordelen, die ook kan worden gebruikt om protease-activiteit te beoordelen. De longimmuniteit tegen Haemophilus influenzae kan worden beoordeeld met behulp van flowcytometrie en confocale microscopie.
Introduction
Haemophilus influenzae (Hi) is een normale commensale bacterie die aanwezig is in de keelholte van de meeste gezonde volwassenen. Hi kan een polysaccharidecapsule hebben (types A-F, bijvoorbeeld type B of HiB) of geen capsule hebben en niet-typebaar zijn (NTHi)1. Kolonisatie van het slijmvlies met deze bacterie begint in de vroege kindertijd en er is een omzet van verschillende koloniserende stammen2. Deze bacterie is ook in staat tot invasie van zowel de bovenste als de onderste luchtwegen; in deze context kan het activering van de immuunrespons en ontsteking induceren 3,4. Deze ontstekingsreactie kan klinische ziekten veroorzaken en bijdragen aan een verscheidenheid aan belangrijke ademhalingsaandoeningen, waaronder sinusitis, otitis media, bronchitis, cystische fibrose, longontsteking en chronische obstructieve longziekte (COPD). De meeste van deze aandoeningen zijn te wijten aan NTHi-stammen2. Dit artikel beschrijft methoden om respiratoire immuunresponsen op Hi te beoordelen met behulp van flowcytometrie en confocale microscopie.
De hieronder beschreven methoden zijn aangepast aan gevestigde technieken die zijn aangepast om de ontstekingsreactie op Hi te beoordelen. De selectie van een geschikte antigene vorm van Hi is een belangrijk onderdeel van deze beoordeling. Antigene preparaten variëren van celwandcomponenten tot levende bacteriën. Om assays vast te stellen en te standaardiseren, kan het gebruik van perifere bloedmonsters in eerste instantie zeer nuttig zijn.
Flowcytometrie maakt het mogelijk om een verscheidenheid aan parameters en functionele testen van één monster op cellulair niveau te meten. Deze techniek heeft het voordeel dat specifieke cellulaire responsen (bijv. productie van reactieve zuurstofsoorten (ROS) of intracellulaire cytokineproductie) kunnen worden beoordeeld in vergelijking met andere meer algemene methoden zoals enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) of ELISspot.
Extracellulaire vallen worden tot expressie gebracht door neutrofielen (NET’s)5,6,7 en door andere cellen zoals macrofagen (METs)8. Ze worden steeds meer erkend als een belangrijke ontstekingsreactie, met name bij infectie in de long9. Ze kunnen worden beoordeeld met confocale fluorescentiemicroscopie. Deze techniek maakt definitieve identificatie van NET’s/METs mogelijk en onderscheidt hun expressie van andere vormen van celdood6.
Zowel flowcytometrie als confocale microscopie zijn op fluorescentie gebaseerde assays. Hun succes is afhankelijk van optimale overbelastingsprotocollen van biologische monsters. Deze methoden hebben enige tijd nodig om te leren en vereisen de juiste toezichthoudende expertise. De betrokken instrumenten zijn ook duur, zowel in aanschaf als in gebruik. De optimale setting voor hun gebruik omvat grote universiteiten en tertiaire verwijzingsziekenhuizen.
De methoden die in dit protocol worden gebruikt, zijn overdraagbaar voor de studie van andere vergelijkbare organismen die betrokken zijn bij luchtwegaandoeningen (bijv. Moxarella catarrhalis en Streptococcus pneumoniae). NTHi interageert ook met andere veel voorkomende respiratoire bacteriën10.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier genoemde methoden maken gebruik van op fluorescentie gebaseerde flowcytometrie en confocale microscopietechnieken die in combinatie kunnen worden gebruikt om gedetailleerde informatie te verkrijgen over de inflammatoire longrespons op Hi.
Het vaststellen van de juiste antigene formulering van Hi die moet worden gebruikt, is van cruciaal belang en het is raadzaam om in dit verband specifieke input van een microbioloog te hebben. Live Hi induceert een sterkere respons, terwijl gedode Hi-…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag de medewerkers van Clinical Immunology bij Monash Health bedanken voor hun hulp bij dit werk.
Materials
| Ammonium chloride | Sigma Aldrich | 213330 | |
| Brefeldin | Sigma Aldrich | B6542 | |
| CD28 | Thermofisher | 16-0289-81 | |
| CD49d | Thermofisher | 534048 | |
| DAPI prolong gold | Thermofisher | P36931 | |
| DHR123 | Sigma Aldrich | 109244-58-8 | |
| Filcon sterile nylon mesh | Becton Dickinson | 340606 | |
| Gelatin substrate, Enzchek | Molecular probes | E12055 | |
| MACS mix tube rotater | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
| Medimachine | Becton Dickinson | Catalogue number not available | |
| Medicons 50 µm | Becton Dickinson | 340592 | |
| Pansorbin | Sigma Aldrich | 507858 | |
| Propidium iodide | Sigma Aldrich | P4170 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | 8047152 | |
| Superfrost slides | Thermofisher | 11562203 |
References
- Smith-Vaughan, H. C., Sriprakash, K. S., Leach, A. J., Mathews, J. D., Kemp, D. J. Low genetic diversity of Haemophilus influenzae type b compared to nonencapsulated H. influenzae in a population in which H. influenzae is highly endemic. Infection and Immunity. 66, 3403-3409 (1998).
- Murphy, T. F. Haemophilus and Moxarella infections. Harrisons Principles of Internal Medicine. 152, (2018).
- King, P. T., Sharma, R. The lung immune response to nontypeable haemophilus influenzae (lung immunity to NTHi). Journal of Immunology Research. , 706376 (2015).
- Ahearn, C. P., Gallo, M. C., Murphy, T. F. Insights on persistent airway infection by non-typeable Haemophilus influenzae in chronic obstructive pulmonary disease. Pathogens and Disease. 75, 9 (2017).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin. Journal of Cell Biology. 198, 773-783 (2012).
- Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nature Medicine. 23, 279-287 (2017).
- Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte. Journal of Leukocyte Biology. 97, 1023-1035 (2015).
- Cheng, O. Z., Palaniyar, N. NET balancing: a problem in inflammatory lung diseases. Frontiers in Immunology. 4, 1 (2013).
- Jacobs, D. M., Ochs-Balcom, H. M., Zhao, J., Murphy, T. F., Sethi, S. Lower airway bacterial colonization patterns and species-specific interactions in chronic obstructive pulmonary disease. Journal of Clinical Microbiology. 56, (2018).
- Barenkamp, S. J., Munson, R. S., Granoff, D. M. Subtyping isolates of Haemophilus influenzae type b by outer-membrane protein profiles. The Journal of Infectious Diseases. 143, 668-676 (1981).
- Barenkamp, S. J. Outer membrane proteins and lipopolysaccharides of nontypeable Haemophilus influenzae. The Journal of Infectious Diseases. 165, 181-184 (1992).
- Johnston, J. W. Laboratory growth and maintenance of Haemophilus influenzae. Current Protocols in Microbiology. , (2010).
- King, P. T., et al. Adaptive immunity to nontypeable Haemophilus influenzae. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 167, 587-592 (2003).
- Coleman, H. N., Daines, D. A., Jarisch, J., Smith, A. L. Chemically defined media for growth of Haemophilus influenzae strains. Journal of Clinical Microbiology. 41, 4408-4410 (2003).
- King, P. T., Ngui, J., Gunawardena, D., Holmes, P. W., Farmer, M. W., Holdsworth, S. R. Systemic humoral immunity to non-typeable Haemophilus influenzae. Clinical & Experimental Immunology. 153, 376-384 (2008).
- King, P. T., et al. Nontypeable Haemophilus influenzae induces sustained lung oxidative stress and protease expression. PLoS One. 10, 0120371 (2015).
- Aaron, S. D., et al. Granulocyte inflammatory markers and airway infection during acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 163, 349-355 (2001).
- King, P. T., et al. Lung T-cell responses to nontypeable Haemophilus influenzae in patients with chronic obstructive pulmonary disease. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 131, 1314-1321 (2013).
- Tsujikawa, T., et al. Robust cell detection and segmentation for image cytometry reveal th17 cell heterogeneity. Cytometry A. 95, 389-398 (2019).
- Sharma, R., O’Sullivan, K. M., Holdsworth, S. R., Bardin, P. G., King, P. T. Visualizing macrophage extracellular traps using confocal microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56459 (2017).
- Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Maniura-Weber, K., Ren, Q. Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide. BMC Microbiology. 15, 36 (2015).
- Ueckert, J. E., Nebe von-Caron, G., Bos, A. P., ter Steeg, P. F. Flow cytometric analysis of Lactobacillus plantarum to monitor lag times, cell division and injury. Letters in Applied Microbiology. 25, 295-299 (1997).
- Essilfie, A. T., et al. Combined Haemophilus influenzae respiratory infection and allergic airways disease drives chronic infection and features of neutrophilic asthma. Thorax. 67, 588-599 (2012).
- Huvenne, W., et al. Exacerbation of cigarette smoke-induced pulmonary inflammation by Staphylococcus aureus enterotoxin B in mice. Respiratory Research. 12, 69 (2011).
- Radhakrishna, N., Farmer, M., Steinfort, D. P., King, P. A Comparison of Techniques for Optimal Performance of Bronchoalveolar Lavage. Journal of Bronchology & Interventional Pulmonology. 22, 300-305 (2015).
- Quatromoni, J. G., Singhal, S., Bhojnagarwala, P., Hancock, W. W., Albelda, S. M., Eruslanov, E. An optimized disaggregation method for human lung tumors that preserves the phenotype and function of the immune cells. Journal of Leukocyte Biology. 97, 201-209 (2015).
- Tighe, R. M., et al. Improving the quality and reproducibility of flow cytometry in the lung. An official American thoracic society workshop report. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 61, 150-161 (2019).
- Yu, Y. R., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLoS One. 11, 0150606 (2016).
- Duan, M., et al. Distinct macrophage subpopulations characterize acute infection and chronic inflammatory lung disease. Journal of Immunology. 189, 946-955 (2012).
