Summary

Beurteilung der respiratorischen Immunantwort auf Haemophilus influenzae

Published: June 29, 2021
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Summary

Haemophilus influenzae induziert Entzündungen in den Atemwegen. Dieser Artikel konzentriert sich auf die Verwendung von Durchflusszytometrie und konfokaler Mikroskopie, um Immunantworten von Phagozyten und Lymphozyten als Reaktion auf dieses Bakterium zu definieren.

Abstract

Haemophilus influenzae (Hi) ist ein weit verbreitetes Bakterium, das bei einer Reihe von Atemwegserkrankungen vorkommt. Eine Vielzahl verschiedener Assays / Techniken kann verwendet werden, um die respiratorische Immun- / Entzündungsreaktion auf dieses Bakterium zu beurteilen. Durchflusszytometrie und konfokale Mikroskopie sind fluoreszenzbasierte Technologien, die eine detaillierte Charakterisierung biologischer Reaktionen ermöglichen. Verschiedene Formen von Hi-Antigen können verwendet werden, einschließlich Zellwandkomponenten, abgetötete / inaktivierte Präparate und lebende Bakterien. Hi ist ein anspruchsvolles Bakterium, das angereicherte Medien benötigt, aber im Allgemeinen in Standardlaborumgebungen leicht zu züchten ist. Gewebeproben zur Stimulation mit Hi können aus peripherem Blut, Bronchoskopie oder resezierter Lunge gewonnen werden (z. B. bei Patienten, die sich einer Operation zur Behandlung von Lungenkrebs unterziehen). Die Funktion von Makrophagen und Neutrophilen kann mittels Durchflusszytometrie umfassend beurteilt werden, wobei eine Vielzahl von Parametern gemessen wird, einschließlich Phagozytose, reaktiver Sauerstoffspezies und intrazellulärer Zytokinproduktion. Die Lymphozytenfunktion (z. B. T-Zell- und NK-Zellfunktion) kann mittels Durchflusszytometrie spezifisch beurteilt werden, hauptsächlich für die intrazelluläre Zytokinproduktion. Hi-Infektion ist ein potenter Induktor der extrazellulären Fallenproduktion, sowohl durch Neutrophile (NETs) als auch durch Makrophagen (METs). Die konfokale Mikroskopie ist wohl der optimalste Weg, um die NET- und MET-Expression zu beurteilen, die auch zur Beurteilung der Proteaseaktivität verwendet werden kann. Die Lungenimmunität gegen Haemophilus influenzae kann mittels Durchflusszytometrie und konfokaler Mikroskopie beurteilt werden.

Introduction

Haemophilus influenzae (Hi) ist ein normales kommensales Bakterium, das im Rachen der meisten gesunden Erwachsenen vorkommt. Hi kann eine Polysaccharidkapsel haben (Typ A-F, z. B. Typ B oder HiB) oder keine Kapsel haben und nicht typisierbar sein (NTHi)1. Die Besiedlung der Schleimhaut mit diesem Bakterium beginnt in der frühen Kindheit, und es gibt einen Umsatz verschiedener kolonisierender Stämme2. Dieses Bakterium ist auch in der Lage, sowohl in die oberen als auch in die unteren Atemwege einzudringen; In diesem Zusammenhang kann es eine Aktivierung der Immunantwort und Entzündung induzieren 3,4. Diese Entzündungsreaktion kann klinische Erkrankungen verursachen und zu einer Vielzahl wichtiger Atemwegserkrankungen beitragen, darunter Sinusitis, Mittelohrentzündung, Bronchitis, Mukoviszidose, Lungenentzündung und chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD). Die meisten dieser Bedingungen sind auf NTHi-Stämmezurückzuführen 2. Dieser Artikel beschreibt Methoden zur Beurteilung der respiratorischen Immunantwort auf Hi mittels Durchflusszytometrie und konfokaler Mikroskopie.

Die unten beschriebenen Methoden wurden von etablierten Techniken adaptiert, die modifiziert wurden, um die Entzündungsreaktion auf Hi zu beurteilen. Die Auswahl einer geeigneten antigenen Form von Hi ist ein wesentlicher Bestandteil dieser Bewertung. Antigene Präparate reichen von Zellwandbestandteilen bis hin zu lebenden Bakterien. Um Assays zu etablieren und zu standardisieren, kann die Verwendung von peripheren Blutproben zunächst sehr hilfreich sein.

Die Durchflusszytometrie ermöglicht die Messung einer Vielzahl von Parametern und funktionellen Assays aus einer Probe auf zellulärer Ebene. Diese Technik hat den Vorteil, dass spezifische zelluläre Reaktionen (z. B. Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) oder intrazelluläre Zytokinproduktion) im Vergleich zu anderen allgemeineren Methoden wie Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) oder ELISspot bewertet werden können.

Extrazelluläre Fallen werden durch Neutrophile (NETs)5,6,7 und durch andere Zellen wie Makrophagen (METs)8 exprimiert. Sie werden zunehmend als eine wichtige Entzündungsreaktion erkannt, insbesondere bei Infektionen in der Lunge9. Sie können durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie beurteilt werden. Diese Technik ermöglicht die definitive Identifizierung von NETs/METs und unterscheidet ihre Expression von anderen Formen desZelltods 6.

Sowohl die Durchflusszytometrie als auch die konfokale Mikroskopie sind fluoreszenzbasierte Assays. Ihr Erfolg hängt von optimalen Belastungsprotokollen biologischer Proben ab. Diese Methoden brauchen einige Zeit, um zu erlernen und erfordern entsprechende Aufsichtskenntnisse. Die beteiligten Instrumente sind auch teuer in der Anschaffung und im Betrieb. Der optimale Rahmen für ihren Einsatz sind große Universitäten und tertiäre Überweisungskrankenhäuser.

Die in diesem Protokoll verwendeten Methoden sind übertragbar auf die Untersuchung anderer ähnlicher Organismen, die an Atemwegserkrankungen beteiligt sind (z. B. Moxarella catarrhalis und Streptococcus pneumoniae). NTHi interagiert auch mit anderen häufigen Atemwegsbakterien10.

Protocol

Diese Arbeit wurde von der Ethikkommission für menschliche Forschung von Monash Health genehmigt. Das Protokoll folgt den Richtlinien der Ethikkommission für Humanforschung. 1. Antigene Zubereitung HINWEIS: Drei verschiedene Antigenpräparate können verwendet werden, um die Immunantwort auf Hi zu beurteilen. Diese sind 1) eine subzelluläre Komponente (typischerweise von der bakteriellen Zellwand); 2) abgetötete und inaktivierte Bakterien; und 3) lebende Bakterien…

Representative Results

Die repräsentativen Ergebnisse zeigen, wie entzündliche Immunantworten auf NTHi mittels Durchflusszytometrie und konfokaler Mikroskopie beurteilt/quantifiziert werden können. Ein wichtiger Teil der Interpretation der Ergebnisse ist der Vergleich der Fluoreszenz zwischen Kontroll- und stimulierten Proben. Eine Reihe von Vorversuchen ist in der Regel erforderlich, um die Färbung von Proben zu optimieren. Wie viele verschiedene Farben gleichzeitig untersucht werden können, hängt von der Anzahl der Kanäle ab, die auf …

Discussion

Die hier aufgeführten Methoden verwenden fluoreszenzbasierte Durchflusszytometrie und konfokale Mikroskopietechniken, die in Verbindung verwendet werden können, um detaillierte Informationen über die entzündliche Lungenantwort auf Hi zu erhalten.

Die Festlegung der geeigneten Antigenformulierung von Hi ist von entscheidender Bedeutung, und es ist ratsam, diesbezüglich spezifische Beiträge von einem Mikrobiologen zu erhalten. Live Hi induziert eine stärkere Reaktion, während abgetötete…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken den Mitarbeitern der Klinischen Immunologie von Monash Health für ihre Unterstützung bei dieser Arbeit.

Materials

Ammonium chloride Sigma Aldrich 213330
Brefeldin Sigma Aldrich B6542
CD28 Thermofisher 16-0289-81
CD49d Thermofisher 534048
DAPI prolong gold Thermofisher P36931
DHR123 Sigma Aldrich 109244-58-8
Filcon sterile nylon mesh Becton Dickinson 340606
Gelatin substrate, Enzchek Molecular probes E12055
MACS mix tube rotater Miltenyi Biotec 130-090-753
Medimachine Becton Dickinson Catalogue number not available
Medicons 50 µm Becton Dickinson 340592
Pansorbin Sigma Aldrich 507858
Propidium iodide Sigma Aldrich P4170
Saponin Sigma Aldrich 8047152
Superfrost slides Thermofisher 11562203

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Cite This Article
Dousha, L., Sharma, R., Lim, S., Ngui, J., Buckle, A. M., King, P. T. Assessing Respiratory Immune Responses to Haemophilus Influenzae. J. Vis. Exp. (172), e62572, doi:10.3791/62572 (2021).

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