의사 바이러스 감염의 높은 처리량 형광 화상 진찰을 사용하여 SARS-CoV-2 중화 항체의 검출
Summary
여기서 설명된 프로토콜은 스파이크 당단백질로 의사형인 향상된 녹색 형광 단백질 표지 된 정맥낭염 바이러스에 의해 감염을 억제하는 병류 혈청 샘플의 능력을 평가함으로써 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 대한 중화 항체를 측정하는 빠르고 효과적인 방법을 설명합니다.
Abstract
중증 급성호흡기증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)로 인한 COVID-19 전염병이 계속 진화함에 따라 바이러스에 대한 항체중화의 존재가 향후 감염에 대한 보호를 제공할 수 있다는 것이 명백해지고 있다. 따라서 효과적인 COVID-19 백신의 생성 및 번역이 전례 없는 속도로 계속됨에 따라 SARS-CoV-2에 대한 중화 항체를 측정하는 빠르고 효과적인 방법의 개발은 이전에 감염되고 예방 접종된 개인 모두에 대한 감염에 대한 장기적인 보호를 결정하는 것이 점점 더 중요해질 것이다. 본 논문은 최근 COVID-19에서 회복된 환자로부터 회복세럼에서 항체를 중화시키는 존재를 측정하기 위해 SARS-CoV-2 스파이크 단백질과 함께 가시성 성 정맥성 구내염 바이러스(VSV)를 이용한 고처리량 프로토콜을 설명합니다. 복제 의사유형 바이러스를 사용하면 SARS-CoV-2 처리에 필요한 봉쇄 레벨 3 시설의 필요성을 제거하여 이 프로토콜을 거의 모든 봉쇄 수준 2 실험실에 액세스할 수 있게 합니다. 96웰 형식을 사용하면 24h의 짧은 처리 시간으로 많은 샘플을 동시에 실행할 수 있습니다.
Introduction
2019년 12월, 새로운 코로나바이러스가 확인되었으며, 현재 코로나바이러스 질환의 원인제인 SARS-CoV-2(COVID-19)1로알고 있다. SARS-CoV-2는 코로나비대 가문에 속하는 베타코로나바이러스입니다. 이러한 봉투바이러스는 큰 양성감지 RNA 게놈을 포함하며 인간과동물2 모두에서 호흡기 및 장 감염에 대한 책임이 있다. 2021년 5월 현재 전 세계적으로 1억 5,700만 건이상의 COVID-19사례가 보고되었으며 320만 명 이상이 사망했다. 효과적인 백신의 발달은 적어도 77의 전임상 백신을 조사하고 90현재 임상 시험을 겪고 있는 전 세계 연구원의 1차 목표가 되었습니다4.
코로나바이러스는 스파이크 단백질(S), 뉴클레오캡시드(N), 봉투 단백질(E), 막 단백질(M)을 포함한 4가지 구조 단백질을 인코딩한다. SARS-CoV-2의 진입은 숙주 수용체와 S의 수용체 결합 도메인(RBD), 인간 혈관신생-변환 효소 2(hACE2), 및 후속 멤브레인 융합다음의 상호 작용이 필요하며, 숙주 세포 세린 프로테제, 트랜스멤브레인 프로테아제 세린 2(TMPRSS2)5,6,7,8,10, 10, 10 . SARS-CoV의 S 단백질의 유머 면역도는 이전에 보고되었으며 현재 SARS-CoV-211,12,13에도대해서도 도시되었다. 실제로, S에 대한 항체 반응을 중화시키는 것은SARS-CoV 환자로부터 24개월 후 SARS-CoV 환자로부터 병영 혈청에서 검출되어 장기 면역 반응에서 중요한 역할을 강조하고 있다. S 단백질은 유망한 백신 표적으로 확인되고 따라서 개발15,16의밑에 대부분의 백신의 핵심 분대가 되었습니다.
중화 항체의 급속한 검출은 백신 발달의 중요한 양상이지만, 또한 영향받은 지역에 있는 감염 및 혈청 역학 감시의 비율에 빛을 비출 수 있습니다17. 생물안전 수준 2 설정에서 SARS-CoV-2 감염을 연구하기 위해, SARS-CoV-2 S 당단백질 대신 SARS-CoV-2 S 당단백질을 가진 복제 유능한 VSV 가시형은 웰란과동료(18)에의해 친절하게 기증되었다. VSV 발현 스파이크(VSV-S)는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 대한 중화 항체 반응을 결정하는 데 활용될 것이다. 여기에서 사용되는 VSV-S는 또한 향상된 녹색 형광 단백질 (eGFP)을 표현하기 때문에, eGFP 포시는 감염을 정량화하기 위해 24 시간 이내에 검출 될 수 있지만 플라크 형성은 48 에서 72 h를 취할 수 있습니다. 여기에 요약VSV-S-eGFP 감염을 중화하는 병결 환자 혈청의 능력을 결정하는 간단하고 효과적인 프로토콜입니다. 이 방법은 또한 SARS-CoV-2 S 단백질의 호스트 바이러스 성 상호 작용을 방해하는 것을 목표로 하는 그밖 잠재적인 치료체를 심문하기 위하여 쉽게 적응될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명된 방법은 필요에 따라 다양한 실험실 환경과 리소스에 맞게 조정될 수 있습니다. 중요한 것은, 이 프로토콜의 주요 한계는 봉쇄 수준 2 공간 및 조직 배양 후드에 대한 필요성이다. VSV-S-eGFP와 같은 SARS-CoV-2 스파이크를 사용하여 가시형RNA 바이러스를 복제하는 응용은, 봉쇄 수준 3 작업 영역을 필요로 하지만, 일부 그룹에 대한 제한으로 남아있을 수 있는 SARS-CoV-2 바이러스에 대한 강력?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 관대이 프로토콜에 사용되는 VSV-S-eGFP 바이러스를 제공 Whelan 실험실감사 (케이스 외. 2020에 설명). 우리는 또한 환자 혈액 샘플을 수집한 빌 카메론 박사와 주타포르 코완 (및 팀)에게 감사드립니다 (REB 프로토콜 ID 20200371-01H). 저자는 이 기사의 연구, 저자 및/또는 출판에 대한 다음과 같은 재정적 지원의 수신을 공개합니다: 이 작품은 오타와 병원 재단의 관대 한 지원과 캐나다 보건 연구 원 (#448323)의 보조금과 COVID-19 과학을위한 엉겅퀴 재단의 빠른 보조금에 의해 조달되었으며, 온타리오 대학원 장학금 및 미택 펠로우십에 자금을 지원합니다. JP는 클러스터 미탁스 펠로우십에 의해 지원됩니다. T.A.는 CIHR 반팅 펠로우십의 지원을 받습니다. 우리는 또한 이 연구 결과에 참가하고 그들의 혈액 견본을 기증한 모든 개별에게 감사하고 싶습니다.
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA (Gibco) | Fisher scientific | LS25200114 | |
| ArrayScan VTI HCS | Thermo Fisher Scientific | Automated fluorescent imager | |
| carboxymethyl cellulose | Sigma | C5678 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (Gibco) | Fisher scientific | 10-013-CV | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (Powder) (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 12-800-017 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Fisher scientific | 21-031-CV | |
| HEPES | Fisher scientific | BP-310-500 | |
| IgG Isotype Control (mouse) | Thermo Fisher Scientific | 31903 | |
| Penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab | SinoBiological | 40592-MM57 | |
| Vero E6 cells | ATCC | CRL-1586 |
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