疑似ウイルス感染のハイスループット蛍光イメージングを用いたSARS-CoV-2中和抗体の検出
Summary
ここで説明するプロトコルは、スパイク糖タンパク質に擬似的に結合した強化された緑色蛍光タンパク質標識付き小胞性口内炎ウイルスによる感染を阻害する回復血清サンプルの能力を評価することによって、SARS-CoV-2スパイクタンパク質に対する中和抗体を測定するための迅速かつ効果的な方法を概説する。
Abstract
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)によって引き起こされるCOVID-19パンデミックが進化し続ける中、ウイルスに対する中和抗体の存在が将来の感染に対する保護を提供することが明らかになりました。したがって、有効なCOVID-19ワクチンの作成と翻訳が前例のないスピードで続く中、SARS-CoV-2に対する中和抗体を測定するための迅速かつ効果的な方法の開発は、以前に感染した個人と予防接種を受けた個人の両方に対する感染に対する長期的な保護を決定するためにますます重要になります。本論文では、最近COVID-19から回復した患者から回復血清中中和抗体の存在を測定するために、SARS-CoV-2スパイクタンパク質を擬似型にしたウイルス性口内炎ウイルス(VSV)を用いた高スループットプロトコルについて説明する。複製擬型ウイルスを使用すると、SARS-CoV-2 処理に必要な封じ込めレベル 3 の機能が不要になり、このプロトコルは事実上すべてのコンテインメント レベル 2 ラボにアクセスできます。96 ウェル形式を使用すると、短いターンアラウンドタイム 24 時間で多くのサンプルを同時に実行できます。
Introduction
2019年12月、コロナウイルスの新しいコロナウイルスが同定され、コロナウイルス病2019(COVID-19)1の原因物質であるSARS-CoV-2と知られています。SARS-CoV-2はコロナビリダ科に属するベタコロナウイルスである。これらのエンベロープウイルスは、大きな陽性感覚RNAゲノムを含み、ヒトおよび動物両方における呼吸器および腸感染症の原因である2。2021年5月時点で、世界中で1億5,700万人以上のCOVID-19の症例が報告されており、320万人以上が死亡しています。効果的なワクチンの開発は、少なくとも77の前臨床ワクチンを調査中で、90は現在臨床試験を受けている世界中の研究者の主要な目標となっています4.
コロナウイルスは、スパイクタンパク質(S)、ヌクレオキャプシド(N)、エンベロープタンパク質(E)、膜タンパク質(M)を含む4つの構造タンパク質をコードする。SARS-CoV-2の侵入には、Sの受容体結合ドメイン(RBD)と宿主受容体、ヒトアンジオテンシン変換酵素2(hACE2)、および宿主細胞セリンプロテアーゼによるタンパク質分解性切断後の膜融合、トランス膜プロテアーゼセリン2(TMPRSS2)5、6、7、8、9、100との相互作用が必要です。.SARS-CoVのSタンパク質の液性免疫優位性は、以前に報告されており、SARS-CoV-211、12、13についても示されています。実際、Sに対する中和抗体応答は、感染24ヶ月後のSARS-CoV患者から回復血清中に検出されており、長期的な免疫応答におけるそれらの重要な役割を強調している。Sタンパク質は有望なワクチン標的として同定されており、開発中のほとんどのワクチンの重要な成分となっています15,16.
中和抗体の迅速な検出はワクチン開発の重要な側面であるが、影響を受けた領域における感染率および血清疫学的サーベイランスの速度に光を当てる可能性もある17。SARS-CoV-2 S糖タンパク質を擬似型の複製能力VSVは、野生型VSV糖タンパク質の代わりに、バイオセーフティレベル2の設定でSARS-CoV-2感染を研究するために、Whelanと同僚18によって親切に寄贈された。VSV発現スパイク(VSV-S)は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質に対する中和抗体応答を決定するために利用される。ここで使用されるVSV-Sは増強された緑色蛍光タンパク質(eGFP)を発現するので、eGFP病巣は感染を定量化するために24時間以内に検出され、プラーク形成には48〜72時間かかることがあります。ここに要約すると、VSV-S-eGFP感染を中和する回復期の患者血清の能力を決定するための簡単で効果的なプロトコルがあります。この方法はまた、SARS-CoV-2 Sタンパク質の宿主とウイルスの相互作用を妨害することを目的とする他の潜在的な治療を尋問するために容易に適応され得る。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明する方法は、必要に応じてさまざまなラボ環境やリソースに合わせて調整できます。重要なことに、このプロトコルの主な制限は、封じ込めレベル2空間および組織培養フードの必要性である。VSV-S-eGFPのようなSARS-CoV-2スパイクを擬似型複製するRNAウイルスの適用は、封じ込めレベル3の作業領域を必要とするSARS-CoV-2ウイルスに代わる手ごわい代替手段であるが、一部のグループで?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Whelanラボは、このプロトコルで使用されるVSV-S-eGFPウイルスを寛大に提供してくれたことに感謝します(Case et al. 2020で説明)。また、患者の血液サンプル(REBプロトコルID 20200371-01H)を収集したビル・キャメロン博士とユタポーン・コーワン博士(およびチーム)に感謝します。著者らは、この記事の研究、著者、および/または出版物に対する次の財政支援の受領を開示する:この研究は、オタワ病院財団からの寛大な支援とカナダ保健研究所(#448323)からの助成金とCOVID-19科学のためのシスルダウン財団からのファストグラントからC.S.I.T.R.J.への迅速な助成金によって資金提供されましたJPは、クラスターMitacsフェローシップによって資金提供されています。T.A.はCIHRバンティング・フェローシップによって資金提供を受けています。また、この研究のために血液サンプルを参加し、寄付したすべての人に感謝したいと思います。
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA (Gibco) | Fisher scientific | LS25200114 | |
| ArrayScan VTI HCS | Thermo Fisher Scientific | Automated fluorescent imager | |
| carboxymethyl cellulose | Sigma | C5678 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (Gibco) | Fisher scientific | 10-013-CV | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (Powder) (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 12-800-017 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Fisher scientific | 21-031-CV | |
| HEPES | Fisher scientific | BP-310-500 | |
| IgG Isotype Control (mouse) | Thermo Fisher Scientific | 31903 | |
| Penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab | SinoBiological | 40592-MM57 | |
| Vero E6 cells | ATCC | CRL-1586 |
References
- Hu, B., Guo, H., Zhou, P., Shi, Z. L. Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19. Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 141-154 (2021).
- Burrell, C. J., Howard, C. R., Murphy, F. A. Coronaviruses. Fenner and White’s Medical Virlogy. , 437-446 (2017).
- COVID-19 Map. Johns Hopkins Coronavirus Resource Center Available from: https://coronavirus.jhu.edu/map.html (2021)
- Covid-19 vaccine tracker. The New York Times Available from: https://www.nytimes.com/interactive/2020/science/coronavirus-vaccine-tracker.html (2021)
- Hoffmann, M., et al. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor. Cell. 181 (2), 271-280 (2020).
- Letko, M., Marzi, A., Munster, V. Functional assessment of cell entry and receptor usage for SARS-CoV-2 and other lineage B betacoronaviruses. Nature Microbiology. 5, 562-569 (2020).
- Azad, T., et al. Nanoluciferase complementation-based bioreporter reveals the importance of N-linked glycosylation of SARS-CoV-2 Spike for viral entry. Molecular Therapy. , (2021).
- Brown, E. E. F., et al. Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268 (2021).
- Azad, T., et al. SARS-CoV-2 S1 NanoBiT: a Nanoluciferase complementation-based biosensor to rapidly probe SARS-CoV-2 receptor recognition. Biosensors and Bioelectronics. 180, 113122 (2021).
- Azad, T., et al. Implications for SARS-CoV-2 vaccine design: Fusion of Spike glycoprotein transmembrane domain to receptor-binding domain induces trimerization. Membranes. 10 (9), 215 (2020).
- Cao, Z., et al. Potent and persistent antibody responses against the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein in recovered patients. Virology Journal. 7, 299 (2010).
- To, K. K. W. Temporal profiles of viral load in posterior oropharyngeal saliva samples and serum antibody responses during infection by SARS-CoV-2: an observational cohort study. The Lancet Infectious Diseases. 20 (5), 565-574 (2020).
- Gao, Q., et al. Development of an inactivated vaccine candidate for SARS-CoV-2. Science. 369 (6499), 77-81 (2020).
- Liu, W., et al. Two-year prospective study of the humoral immune response of patients with severe acute respiratory syndrome. Journal of Infectious Diseases. 193 (6), 792-795 (2006).
- Dong, Y., et al. A systematic review of SARS-CoV-2 vaccine candidates. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 237 (2020).
- Amanat, F., Krammer, F. SARS-CoV-2 vaccines: Status report. Immunity. 52 (4), 583-589 (2020).
- Amanat, F., et al. A serological assay to detect SARS-CoV-2 seroconversion in humans. Nature Medicine. 26 (7), 1033-1036 (2020).
- Case, J. B., et al. Neutralizing antibody and soluble ACE2 inhibition of a replication-competent VSV-SARS-CoV-2 and a clinical isolate of SARS-CoV-2. Cell Host and Microbe. 28 (3), 475-485 (2020).
- Garcia-Beltran, W. F., et al. Journal Pre-proof COVID-19 neutralizing antibodies predict disease severity and survival. Cell. 184 (2), 476-488 (2020).
- Zeng, C., et al. Neutralizing antibody against SARS-CoV-2 spike in COVID-19 patients, health care workers, and convalescent plasma donors. JCI insight. 5 (22), (2020).
- Whitman, J. D., et al. Evaluation of SARS-CoV-2 serology assays reveals a range of test performance. Nature Biotechnology. 38 (10), 1174-1183 (2020).
- Ainsworth, M., et al. Performance characteristics of five immunoassays for SARS-CoV-2: a head-to-head benchmark comparison. The Lancet Infectious Diseases. 20 (12), 1390-1400 (2020).
- Sharifkashani, S., et al. Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) receptor and SARS-CoV-2: Potential therapeutic targeting. European Journal of Pharmacology. 884, 173455 (2020).
- Burki, T. Understanding variants of SARS-CoV-2. The Lancet. 397 (10273), 462 (2021).
- Jayamohan, H., et al. SARS-CoV-2 pandemic: a review of molecular diagnostic tools including sample collection and commercial response with associated advantages and limitations. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 413 (1), 49-71 (2020).
- Nie, J., et al. Quantification of SARS-CoV-2 neutralizing antibody by a pseudotyped virus-based assay. Nature Protocols. 15 (11), 3699-3715 (2020).
- Crawford, K. H. D., et al. Protocol and reagents for pseudotyping lentiviral particles with SARS-CoV-2 spike protein for neutralization assays. Viruses. 12 (5), 513 (2020).
