الكشف عن الأجسام المضادة المحايدة للسارس-CoV-2 باستخدام التصوير الفلوري عالي الإنتاجية للعدوى بالفيروس الزائف
Summary
يحدد البروتوكول الموصوف هنا طريقة سريعة وفعالة لقياس تحييد الأجسام المضادة ضد بروتين ارتفاع السارس-CoV-2 من خلال تقييم قدرة عينات المصل النقاهة على منع العدوى عن طريق فيروس التهاب الفم الفلوري الأخضر المعزز المسمى بالبروتين المركبات الزائف مع ارتفاع الجليكوبروتين.
Abstract
ومع استمرار تطور جائحة COVID-19 الناجمة عن الفيروس التاجي للمتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة 2 (سارس-كوف-2)، أصبح من الواضح أن وجود أجسام مضادة لتحييد الفيروس قد يوفر الحماية من العدوى في المستقبل. وهكذا، ومع استمرار إنشاء وترجمة لقاحات فعالة من نوع COVID-19 بسرعة لم يسبق لها مثيل، فإن تطوير أساليب سريعة وفعالة لقياس تحييد الأجسام المضادة ضد السارس-CoV-2 سيصبح ذا أهمية متزايدة لتحديد الحماية طويلة الأجل من العدوى لكل من الأفراد المصابين سابقا والمحصنين. تصف هذه الورقة بروتوكولا عالي الإنتاجية باستخدام فيروس التهاب الفم الحويصلات (VSV) الزائف مع بروتين ارتفاع السارس-CoV-2 لقياس وجود الأجسام المضادة المحايدة في مصل النقاهة من المرضى الذين تعافوا مؤخرا من COVID-19. إن استخدام فيروس زائف التكرار يلغي الحاجة إلى مرفق احتواء من المستوى 3 مطلوب للتعامل مع السارس-CoV-2، مما يجعل هذا البروتوكول في متناول أي مختبر من مستوى الاحتواء 2 تقريبا. استخدام شكل 96 جيدا يسمح للعديد من العينات ليتم تشغيلها في نفس الوقت مع وقت تحول قصير من 24 ساعة.
Introduction
في ديسمبر 2019 ، تم تحديد فيروس كورونا الجديد ، والذي نعرفه الآن باسم SARS-CoV-2 ، العامل المسبب لمرض الفيروس التاجي 2019 (COVID-19)1. سارس-كوف-2 هو فيروس بيتاكورونا ينتمي إلى عائلة كورونافيريداي. هذه الفيروسات المغلفة تضم جينوم الحمض النووي الريبي كبير إيجابي الإحساس وهي مسؤولة عن التهابات الجهاز التنفسي والأمعاء في كل من البشر والحيوانات2. وحتى مايو 2021، تم الإبلاغ عن أكثر من 157 مليون حالة إصابة ب COVID-19 على مستوى العالم وأكثر من 3.2 مليون حالة وفاة3. أصبح تطوير لقاح فعال الهدف الرئيسي للباحثين في جميع أنحاء العالم مع ما لا يقل عن 77 لقاحا قبل السريري قيد التحقيق و90 يخضع حاليا لتجارب سريرية4.
الفيروسات التاجية ترميز أربعة بروتينات الهيكلية بما في ذلك البروتين ارتفاع (S), nucleocapsid (N), بروتين المغلف (E), وبروتين الغشاء (M). دخول سارس-CoV-2 يتطلب التفاعل بين المجال مستقبلات ملزمة (RBD) من S مع مستقبلات المضيف, أنزيم تحويل الأنجيوتنسين الإنسان 2 (hACE2), وانصهار الغشاء اللاحقة بعد انشقاق بروتيوليتيك بواسطة بروتياز سيرين الخلوية المضيفة, transmembrane protease سيرين 2 (TMPRSS2)5,6,7,8,9,10 . وقد تم الإبلاغ سابقا عن المناعية الفكاهية للبروتين S من السارس-CoV وقد ثبت الآن أيضا للسارس-CoV-211,12,13. في الواقع ، تم الكشف عن تحييد استجابات الأجسام المضادة ضد S في مصل النقاهة من مرضى السارس -CoV بعد 24 شهرا من العدوى14، مما يسلط الضوء على دورهم الحاسم في الاستجابة المناعية على المدى الطويل. وقد تم تحديد البروتين S كهدف لقاح واعدة، وبالتالي أصبح عنصرا رئيسيا في معظم اللقاحات قيد التطوير15،16.
وفي حين أن الكشف السريع عن تحييد الأجسام المضادة جانب حاسم من جوانب تطوير اللقاح، فإنه قد يلقي الضوء أيضا على معدل العدوى والمراقبة المصلية الوبائية في المناطق المتضررة17. النسخ المتماثل المختصة VSV الزائفة مع السارس-CoV-2 S glycoprotein, بدلا من البروتين البروتيني VSV البرية من نوع, لدراسة عدوى السارس-CoV-2 في إعدادات مستوى السلامة البيولوجية 2 تبرعت بلطف من قبل ويلان وزملاء العمل18. سيتم استخدام VSV التعبير عن ارتفاع (VSV-S) لتحديد استجابة الأجسام المضادة تحييد ضد بروتين ارتفاع السارس-CoV-2. كما VSV-S المستخدمة هنا يعبر أيضا عن تعزيز البروتين الفلوري الأخضر (eGFP), قد يتم الكشف عن بؤر eGFP في غضون 24 ساعة لقياس العدوى, في حين أن تشكيل البلاك يمكن أن يستغرق 48 إلى 72 ساعة. ملخص هنا هو بروتوكول بسيط وفعال لتحديد قدرة مصل المريض النقاهة لتحييد العدوى VSV-S-eGFP. ويمكن أيضا تكييف هذه الطريقة بسهولة لاستجواب العلاجات المحتملة الأخرى التي تهدف إلى تعطيل التفاعل الفيروسي المضيف للبروتين سارس-CoV-2 S.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويمكن تكييف الطريقة الموصوفة هنا لتناسب بيئات المختبر وموارده المختلفة حسب الحاجة. الأهم من ذلك، القيد الرئيسي لهذا البروتوكول هو ضرورة وجود مستوى الاحتواء 2 الفضاء والأنسجة غطاء محرك السيارة. إن تطبيق فيروس الحمض النووي الريبي المستنسخ الزائف مع ارتفاع السارس-CoV-2، مثل VSV-S-eGFP، هو بديل هائ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر مختبر ويلان على توفير فيروس VSV-S-eGFP المستخدم في هذا البروتوكول بسخاء (الموصوف في الحالة وآخرون 2020). نشكر أيضا الدكتورين بيل كاميرون وجوثابورن كوان (والفريق) لجمع عينات دم المريض (معرف بروتوكول REB 20200371-01H). يكشف المؤلفون عن تلقي الدعم المالي التالي للبحث والتأليف و / أو نشر هذه المقالة: تم تمويل هذا العمل من الدعم السخي من مؤسسة مستشفى أوتاوا ومنحة من المعاهد الكندية للبحوث الصحية (#448323) ومنحة سريعة من مؤسسة Thistledown للعلوم COVID-19 إلى C.S.I. T.R.J. يتم تمويلها من منحة أونتاريو للدراسات العليا وزمالة Mitacs العنقودية. يتم تمويل JP من قبل زمالة Mitacs العنقودية. T.A. ممولة من زمالة CIHR Banting. كما نود أن نشكر جميع الأفراد الذين شاركوا وتبرعوا بعينات دمهم لهذه الدراسة.
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA (Gibco) | Fisher scientific | LS25200114 | |
| ArrayScan VTI HCS | Thermo Fisher Scientific | Automated fluorescent imager | |
| carboxymethyl cellulose | Sigma | C5678 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (Gibco) | Fisher scientific | 10-013-CV | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (Powder) (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 12-800-017 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Fisher scientific | 21-031-CV | |
| HEPES | Fisher scientific | BP-310-500 | |
| IgG Isotype Control (mouse) | Thermo Fisher Scientific | 31903 | |
| Penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab | SinoBiological | 40592-MM57 | |
| Vero E6 cells | ATCC | CRL-1586 |
References
- Hu, B., Guo, H., Zhou, P., Shi, Z. L. Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19. Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 141-154 (2021).
- Burrell, C. J., Howard, C. R., Murphy, F. A. Coronaviruses. Fenner and White’s Medical Virlogy. , 437-446 (2017).
- COVID-19 Map. Johns Hopkins Coronavirus Resource Center Available from: https://coronavirus.jhu.edu/map.html (2021)
- Covid-19 vaccine tracker. The New York Times Available from: https://www.nytimes.com/interactive/2020/science/coronavirus-vaccine-tracker.html (2021)
- Hoffmann, M., et al. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor. Cell. 181 (2), 271-280 (2020).
- Letko, M., Marzi, A., Munster, V. Functional assessment of cell entry and receptor usage for SARS-CoV-2 and other lineage B betacoronaviruses. Nature Microbiology. 5, 562-569 (2020).
- Azad, T., et al. Nanoluciferase complementation-based bioreporter reveals the importance of N-linked glycosylation of SARS-CoV-2 Spike for viral entry. Molecular Therapy. , (2021).
- Brown, E. E. F., et al. Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268 (2021).
- Azad, T., et al. SARS-CoV-2 S1 NanoBiT: a Nanoluciferase complementation-based biosensor to rapidly probe SARS-CoV-2 receptor recognition. Biosensors and Bioelectronics. 180, 113122 (2021).
- Azad, T., et al. Implications for SARS-CoV-2 vaccine design: Fusion of Spike glycoprotein transmembrane domain to receptor-binding domain induces trimerization. Membranes. 10 (9), 215 (2020).
- Cao, Z., et al. Potent and persistent antibody responses against the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein in recovered patients. Virology Journal. 7, 299 (2010).
- To, K. K. W. Temporal profiles of viral load in posterior oropharyngeal saliva samples and serum antibody responses during infection by SARS-CoV-2: an observational cohort study. The Lancet Infectious Diseases. 20 (5), 565-574 (2020).
- Gao, Q., et al. Development of an inactivated vaccine candidate for SARS-CoV-2. Science. 369 (6499), 77-81 (2020).
- Liu, W., et al. Two-year prospective study of the humoral immune response of patients with severe acute respiratory syndrome. Journal of Infectious Diseases. 193 (6), 792-795 (2006).
- Dong, Y., et al. A systematic review of SARS-CoV-2 vaccine candidates. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 237 (2020).
- Amanat, F., Krammer, F. SARS-CoV-2 vaccines: Status report. Immunity. 52 (4), 583-589 (2020).
- Amanat, F., et al. A serological assay to detect SARS-CoV-2 seroconversion in humans. Nature Medicine. 26 (7), 1033-1036 (2020).
- Case, J. B., et al. Neutralizing antibody and soluble ACE2 inhibition of a replication-competent VSV-SARS-CoV-2 and a clinical isolate of SARS-CoV-2. Cell Host and Microbe. 28 (3), 475-485 (2020).
- Garcia-Beltran, W. F., et al. Journal Pre-proof COVID-19 neutralizing antibodies predict disease severity and survival. Cell. 184 (2), 476-488 (2020).
- Zeng, C., et al. Neutralizing antibody against SARS-CoV-2 spike in COVID-19 patients, health care workers, and convalescent plasma donors. JCI insight. 5 (22), (2020).
- Whitman, J. D., et al. Evaluation of SARS-CoV-2 serology assays reveals a range of test performance. Nature Biotechnology. 38 (10), 1174-1183 (2020).
- Ainsworth, M., et al. Performance characteristics of five immunoassays for SARS-CoV-2: a head-to-head benchmark comparison. The Lancet Infectious Diseases. 20 (12), 1390-1400 (2020).
- Sharifkashani, S., et al. Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) receptor and SARS-CoV-2: Potential therapeutic targeting. European Journal of Pharmacology. 884, 173455 (2020).
- Burki, T. Understanding variants of SARS-CoV-2. The Lancet. 397 (10273), 462 (2021).
- Jayamohan, H., et al. SARS-CoV-2 pandemic: a review of molecular diagnostic tools including sample collection and commercial response with associated advantages and limitations. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 413 (1), 49-71 (2020).
- Nie, J., et al. Quantification of SARS-CoV-2 neutralizing antibody by a pseudotyped virus-based assay. Nature Protocols. 15 (11), 3699-3715 (2020).
- Crawford, K. H. D., et al. Protocol and reagents for pseudotyping lentiviral particles with SARS-CoV-2 spike protein for neutralization assays. Viruses. 12 (5), 513 (2020).
