Summary

Очистка и расширение мышечных инвариантных естественных Т-киллеров для исследований in vitro и in vivo

Published: February 15, 2021
doi:

Summary

Мы описываем быстрый и надежный протокол для обогащения инвариантных естественных Т-киллеров (iNKT) клеток из мышиной селезенки и расширения их in vitro до подходящих чисел для исследований in vitro и in vivo.

Abstract

Инвариантные естественные Т-киллеры (iNKT) представляют собой врожденные Т-лимфоциты, экспрессирующие сохраненный полуинвариантный Т-клеточный рецептор (TCR), специфичный для собственных или микробных липидных антигенов, представленных неполиморфной молекулой CD1d, связанной с MHC класса I. Доклинические и клинические исследования подтверждают роль iNKT-клеток в раке, аутоиммунитете и инфекционных заболеваниях. Клетки iNKT очень сохранены во всех видах, и их исследование было облегчено мышиными моделями, включая мышей с дефицитом CD1d или iNKT-дефицитом, и возможностью однозначно обнаружить их у мышей и мужчин с тетрамерами CD1d или mAbs, специфичными для полуинвариантного TCR. Тем не менее, клетки iNKT редки, и их необходимо расширить, чтобы достичь управляемых чисел для любого исследования. Поскольку генерация первичной мышиной клеточной линии iNKT in vitro оказалась сложной, мы создали надежный протокол для очистки и расширения селезеночных клеток iNKT у трансгенных мышей iVα14-Jα18 (iVα14Tg), у которых клетки iNKT встречаются в 30 раз чаще. Здесь мы показываем, что первичные селезеночные iVα14Tg iNKT клетки могут быть обогащены с помощью процесса иммуномагнитного разделения, давая около 95-98% чистых клеток iNKT. Очищенные клетки iNKT стимулируются шариками против CD3/CD28 плюс IL-2 и IL-7, в результате чего к дню происходит 30-кратное расширение +14 культуры с чистотой 85-99%. Расширенными клетками iNKT можно легко генетически манипулировать, обеспечивая бесценный инструмент для препарирования механизмов активации и функционирования in vitro и, что более важно, также при приемном переносе in vivo.

Introduction

Инвариантные естественные Т-клетки-киллеры (iNKT-клетки) представляют собой врожденные Т-лимфоциты, которые экспрессируют полуинвариантный рецептор αβ Т-клеток (TCR), образованный у мышей инвариантной цепью Vα14-Jα18 в паре с ограниченным набором разнообразных Vβ-цепей1,который специфичен для липидных антигенов, представленных молекулой CD1d2класса I MHC. Клетки iNKT проходят программу отбора агонистов, в результате чего уже в тимусе происходит приобретение активированного/врожденного эффекторного фенотипа, который происходит через несколько стадий созревания3,4,продуцируяCD4+ и CD4подмножество. Благодаря этой программе клетки iNKT приобретают различные эффекторные фенотипыT-хелпера(T H), а именно TH1 (iNKT1), TH2 (iNKT2) и TH17 (iNKT17), идентифицируемые по экспрессии транскрипционных факторов T-bet, GATA3, PLZF и RORγt соответственно5. Клетки iNKT распознают ряд микробных липидов, но также самореактивны против эндогенных липидов, которые регулируются в контексте патологических ситуаций клеточного стресса и повреждения тканей, таких как рак и аутоиммунитет2. После активации клетки iNKT модулируют функции других врожденных и адаптивных иммунных эффекторных клеток посредством прямого контакта и производства цитокинов2.

Исследования клеток iNKT были облегчены мышиными моделями, включая мышей с дефицитом CD1d или Jα18, а также производством антиген-нагруженных cd1d тетрамеров плюс генерация моноклональных антител (mAbs), специфичных для полуинвариантного TCR человека. Однако генерация первичной мышиной клеточной линии iNKT оказалась затруднительной. Чтобы лучше охарактеризовать противоопухолевые функции клеток iNKT и использовать их для приемной клеточной терапии, мы создали протокол для очистки и расширения селезеночных iNKT-клеток трансгенных мышей iVα14-Jα18 (iVα14Tg)6,у которых клетки iNKT встречаются в 30 раз чаще, чем у мышей дикого типа.

Расширенные клетки iNKT могут быть использованы для анализов in vitro и in vivo при переносе обратно мышам. В этой обстановке, например, мы показали их мощные противоопухолевые эффекты7. Кроме того, расширенные in vitro клетки iNKT поддаются функциональной модификации посредством переноса или редактирования генов до их инъекции in vivo8,что позволяет проводить глубокий функциональный анализ молекулярных путей, а также прокладывать путь для передовой клеточной терапии.

Protocol

Процедуры, описанные здесь, были рассмотрены и одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) (No 1048) в Научном институте Сан-Раффаэле. ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры должны выполняться в стерильных условиях. Все используемые реагенты переч?…

Representative Results

Протокол, описанный в этой рукописи, позволяет обогатить клетки iNKT из селезенки трансгенных мышей iVa14-Ja18 посредством процесса иммуномагнитного разделения, обобщенного на рисунке 1А. Общие Т-клетки селезенки сначала отрицательно отбираются путем истощения В-клеток и мо?…

Discussion

Здесь мы показываем воспроизводимый и осуществимый протокол для получения миллионов готовых к использованию iNKT-клеток. Из-за нехватки этих клеток in vivo метод их расширения был крайне необходим. Протокол, который мы предлагаем, не требует ни конкретного прибора, ни большого количества м?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Благодарим Паоло Делабону и Джулию Касорати за научную поддержку и критическое прочтение рукописи. Мы также благодарим NIH Tetramer Core Facility за мышиный тетрамер CD1d. Исследование финансировалось Fondazione Cariplo Grant 2018-0366 (для M.F.) и стипендией Итальянской ассоциации по исследованию рака (AIRC) 2019-22604 (для G.D.).

Materials

Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) solution in house 0.15M NH4Cl, 10mM KHCO3, 0.1mM EDTA, pH 7.2-7.4
anti-FITC Microbeads Miltenyi Biotec 130-048-701
anti-PE Microbeads Miltenyi Biotec 130-048-801
Brefeldin A Sigma B6542
CD19 -FITC Biolegend 115506 clone 6D5
CD1d-tetramer -PE NIH tetramer core facility mouse PBS57-Cd1d-tetramers
CD4 -PeCy7 Biolegend 100528 clone RM4-5
Fc blocker BD Bioscience 553142
Fetal Bovine Serum (FBS) Euroclone ECS0186L heat-inactivated and filtered .22 before use
FOXP3 Transcription factor staining buffer eBioscience 00-5523-00
H2 (IAb) -FITC Biolegend 114406 clone AF6-120.1
hrIL-2 Chiron Corp
Ionomycin Sigma I0634
LD Columns Miltenyi Biotec 130-042-901
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401
MACS buffer (MB) in house 0.5% Bovine Serum Albumin (BSA; Sigma-Aldrich) and 2Mm EDTA
MS Columns Miltenyi Biotec 130-042-201
Non-essential amino acids Gibco 11140-035
Penicillin and streptomycin (Pen-Strep) Lonza 15140-122
PermWash BD Bioscience 51-2091KZ
PFA Sigma P6148
Phosphate buffered saline (PBS) EuroClone ECB4004L
PMA Sigma P1585
Pre-Separation Filters (30 µm) Miltenyi Biotec 130-041-407
Recombinat Mouse IL-7 R&D System 407-ML-025
RPMI 1640 with glutamax Gibco 61870-010
sodium pyruvate Gibco 11360-039
TCRβ -APC Biolegend 109212 clone H57-597
αCD3CD28 mouse T activator Dynabeads Gibco 11452D
β-mercaptoethanol Gibco 31350010

References

  1. Bendelac, A., Savage, P. B., Teyton, L. The biology of NKT cells. Annual Review of Immunology. 25, 297-336 (2007).
  2. Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions. Nature Reviews: Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).
  3. Pellicci, D. G., et al. A natural killer T (NKT) cell developmental pathway iInvolving a thymus-dependent NK1.1(-)CD4(+) CD1d-dependent precursor stage. Journal of Experimental Medicine. 195 (7), 835-844 (2002).
  4. Benlagha, K., Kyin, T., Beavis, A., Teyton, L., Bendelac, A. A thymic precursor to the NK T cell lineage. Science. 296 (5567), 553-555 (2002).
  5. Lee, Y. J., Holzapfel, K. L., Zhu, J., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Steady-state production of IL-4 modulates immunity in mouse strains and is determined by lineage diversity of iNKT cells. Nature Immunology. 14 (11), 1146-1154 (2013).
  6. Griewank, K., et al. Homotypic interactions mediated by Slamf1 and Slamf6 receptors control NKT cell lineage development. Immunity. 27 (5), 751-762 (2007).
  7. Cortesi, F., et al. Bimodal CD40/Fas-Dependent Crosstalk between iNKT Cells and Tumor-Associated Macrophages Impairs Prostate Cancer Progression. Cell Reports. 22 (11), 3006-3020 (2018).
  8. Heczey, A., et al. Invariant NKT cells with chimeric antigen receptor provide a novel platform for safe and effective cancer immunotherapy. Blood. 124 (18), 2824-2833 (2014).
  9. Liu, Y., et al. A modified alpha-galactosyl ceramide for staining and stimulating natural killer T cells. Journal of Immunological Methods. 312 (1-2), 34-39 (2006).
  10. Chiba, A., et al. Rapid and reliable generation of invariant natural killer T-cell lines in vitro. Immunology. 128 (3), 324-333 (2009).
  11. Crowe, N. Y., et al. Differential antitumor immunity mediated by NKT cell subsets in vivo. Journal of Experimental Medicine. 202 (9), 1279-1288 (2005).
  12. de Lalla, C., et al. Production of profibrotic cytokines by invariant NKT cells characterizes cirrhosis progression in chronic viral hepatitis. Journal of Immunology. 173 (2), 1417-1425 (2004).
  13. Tian, G., et al. CD62L+ NKT cells have prolonged persistence and antitumor activity in vivo. Journal of Clinical Investigation. 126 (6), 2341-2355 (2016).
  14. Gaya, M., et al. Initiation of Antiviral B Cell Immunity Relies on Innate Signals from Spatially Positioned NKT Cells. Cell. 172 (3), 517-533 (2018).
  15. Rotolo, A., et al. Enhanced Anti-lymphoma Activity of CAR19-iNKT Cells Underpinned by Dual CD19 and CD1d Targeting. Cancer Cell. 34 (4), 596-610 (2018).
  16. Schneidawind, D., et al. Third-party CD4+ invariant natural killer T cells protect from murine GVHD lethality. Blood. 125 (22), 3491-3500 (2015).
  17. Schneidawind, D., et al. CD4+ invariant natural killer T cells protect from murine GVHD lethality through expansion of donor CD4+CD25+FoxP3+ regulatory T cells. Blood. 124 (22), 3320-3328 (2014).
  18. Schneidawind, D., Pierini, A., Negrin, R. S. Regulatory T cells and natural killer T cells for modulation of GVHD following allogeneic hematopoietic cell transplantation. Blood. 122 (18), 3116-3121 (2013).
  19. Leveson-Gower, D. B., et al. Low doses of natural killer T cells provide protection from acute graft-versus-host disease via an IL-4-dependent mechanism. Blood. 117 (11), 3220-3229 (2011).
  20. Coman, T., et al. Human CD4- invariant NKT lymphocytes regulate graft versus host disease. Oncoimmunology. 7 (11), 1470735 (2018).
  21. Xu, X., et al. NKT Cells Coexpressing a GD2-Specific Chimeric Antigen Receptor and IL15 Show Enhanced In vivo Persistence and Antitumor Activity against Neuroblastoma. Clinical Cancer Research. 25 (23), 7126-7138 (2019).
  22. Heczey, A., et al. Anti-GD2 CAR-NKT cells in patients with relapsed or refractory neuroblastoma: an interim analysis. Nature Medicine. 26 (11), 1686-1690 (2020).
  23. Exley, M. A., et al. Adoptive Transfer of Invariant NKT Cells as Immunotherapy for Advanced Melanoma: A Phase I Clinical Trial. Clinical Cancer Research. 23 (14), 3510-3519 (2017).
  24. Wolf, B. J., Choi, J. E., Exley, M. A. Novel Approaches to Exploiting Invariant NKT Cells in Cancer Immunotherapy. Frontiers in Immunology. 9, 384 (2018).

Play Video

Cite This Article
Delfanti, G., Perini, A., Zappa, E., Fedeli, M. Purification and Expansion of Mouse Invariant Natural Killer T Cells for in vitro and in vivo Studies. J. Vis. Exp. (168), e62214, doi:10.3791/62214 (2021).

View Video