Summary

Purificação e Expansão de Células T Assassinos Naturais Invariantes para Estudos In vitro e In vivo

Published: February 15, 2021
doi:

Summary

Descrevemos um protocolo rápido e robusto para enriquecer células T (iNKT) invariantes do assassino natural do baço do rato e expandi-las in vitro para números adequados para estudos in vitro e in vivo.

Abstract

As células T (iNKT) invariantes são linfócitos T inatas que expressam um receptor de células T semi-invariante (TCR) conservado específico para antígenos lipídicos auto ou microbianos apresentados pela molécula não polimórfica relacionada ao MHC CD1d. Estudos pré-clínicos e clínicos apoiam um papel para células iNKT em câncer, autoimunidade e doenças infecciosas. As células iNKT são muito conservadas em todas as espécies e sua investigação foi facilitada por modelos de camundongos, incluindo camundongos deficientes de CD1d ou deficientes em INKT, e a possibilidade de detectá-las inequivocamente em camundongos e homens com tetramers CD1d ou mAbs específicos para o TCR semi-invariante. No entanto, as células iNKT são raras e precisam ser expandidas para alcançar números gerenciáveis para qualquer estudo. Como a geração da linha celular iNKT primária do mouse in vitro tem se mostrado difícil, criamos um protocolo robusto para purificar e expandir células iNKT esplênicas a partir dos camundongos transgênicos iVα14-Jα18 (iVα14Tg), nos quais as células iNKT são 30 vezes mais frequentes. Mostramos aqui que as células iVα14Tg iNKT primárias podem ser enriquecidas através de um processo de separação imunomagnética, produzindo cerca de 95-98% de células iNKT puras. As células iNKT purificadas são estimuladas por contas anti-CD3/CD28 mais IL-2 e IL-7, resultando em expansão de 30 vezes até o dia +14 da cultura com 85-99% de pureza. As células iNKT expandidas podem ser facilmente manipuladas geneticamente, fornecendo uma ferramenta inestimável para dissecar mecanismos de ativação e função in vitro e, mais importante, também após transferência adotiva in vivo.

Introduction

Invariantes Células T assassinas naturais (células iNKT) são linfócitos T inatas que expressam um receptor de células αβ T semi-invariante (TCR), formado em camundongos por uma cadeia vα14-Jα18 inata emparelhada com um conjunto limitado de diversas cadeias Vβ1, que é específica para antígenos lipídicos apresentados pela molécula de classe I da MHC CD1d2. as células iNKT passam por um programa de seleção agonista, resultando na aquisição de um fenótipo ativado/inato do efeito ou do tímumo, que ocorre através de várias etapas de maturação3,4, produzindo um cd4+ e um subconjunto CD4. Através deste programa, as células iNKT adquirem fenótipos de efeito t (TH) distintos, ou seja, TH1 (iNKT1), TH2 (iNKT2) e TH17 (iNKT17), identificáveis pela expressão dos fatores de transcrição T-bet, GATA3, PLZF e RORγt,respectivamente 5. As células iNKT reconhecem uma gama de lipídios microbianos, mas também são auto-reativas contra lipídios endógenos que são regulados no contexto de situações patológicas de estresse celular e danos teciduais, como câncer e autoimunidade2. Após a ativação, as células iNKT modulam as funções de outras células inatas e adaptativas do efeito imunológico através do contato direto e da produção de citocinas2.

As investigações das células iNKT foram facilitadas por modelos de camundongos, incluindo camundongos deficientes de CD1d ou Jα18 deficientes, e pela produção de tetramers CD1d carregados de antígeno mais a geração de anticorpos monoclonais (mAbs) específicos para o TCR semi-invariante humano. No entanto, a geração da linha celular iNKT do mouse primário tem se mostrado difícil. Para caracterizar melhor as funções antitumorais das células iNKT e utilizá-las para a terapia celular adotiva, criamos um protocolo para purificar e expandir células esfécnicas iNKT de camundongos transgênicos iVα14-Jα18 (iVα14Tg)6, em que as células iNKT são 30 vezes mais frequentes do que em camundongos do tipo selvagem.

Células iNKT expandidas podem ser exploradas para ensaios in vitro, e in vivo após transferência de volta para camundongos. Neste cenário, por exemplo, mostramos seus potentes efeitos anti-tumor7. Além disso, as células iNKT expandidas in vitro são favoráveis à modificação funcional via transferência ou edição de genes antes de sua injeção in vivo8, permitindo uma análise funcional perspicaz das vias moleculares, bem como abrindo caminho para terapias celulares avançadas.

Protocol

Os procedimentos aqui descritos foram revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Atenção e Uso de Animais (IACUC) (nº 1048) do Instituto Científico de San Raffaele. NOTA: Todos os procedimentos devem ser realizados em condições estéreis. Todos os reagentes utilizados estão listados na Tabela de Materiais. 1. Processamento de baço Eutanize os camundongos iVα14-Jα18 por inalação de CO2 de acordo com a políti…

Representative Results

O protocolo descrito neste manuscrito permite enriquecer células iNKT do baço de camundongos transgênicos iVa14-Ja18 através de um processo de separação imunomagnética resumido na Figura 1A. As células T do baço total são primeiramente selecionadas negativamente pelo esgotamento das células B e monócitos, seguidas pela classificação imunomagnética positiva da célula iNKT com tetramers CD1d carregados de antígeno lipídico PBS-57, que permitem manchar especificamente apenas c…

Discussion

Aqui mostramos um protocolo reprodutível e viável para obter milhões de células iNKT prontas para uso. Devido à escassez dessas células in vivo, um método para expandi-las era altamente necessário. O protocolo que propomos não requer uma instrumentação específica nem um alto número de ratos. Exploramos camundongos transgênicos iVα14-Jα18 de propósito para reduzir o número de camundongos necessários para o procedimento.

Outro protocolo bem sucedido para expansão celular iNKT…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Paolo Dellabona e Giulia Casorati pelo apoio científico e leitura crítica do manuscrito. Agradecemos também ao NIH Tetramer Core Facility pelo tetramer CD1d do mouse. O estudo foi financiado pela fondazione Cariplo Grant 2018-0366 (para m.F.) e associação italiana de pesquisa do câncer (AIRC) bolsa 2019-22604 (para G.D.).

Materials

Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) solution in house 0.15M NH4Cl, 10mM KHCO3, 0.1mM EDTA, pH 7.2-7.4
anti-FITC Microbeads Miltenyi Biotec 130-048-701
anti-PE Microbeads Miltenyi Biotec 130-048-801
Brefeldin A Sigma B6542
CD19 -FITC Biolegend 115506 clone 6D5
CD1d-tetramer -PE NIH tetramer core facility mouse PBS57-Cd1d-tetramers
CD4 -PeCy7 Biolegend 100528 clone RM4-5
Fc blocker BD Bioscience 553142
Fetal Bovine Serum (FBS) Euroclone ECS0186L heat-inactivated and filtered .22 before use
FOXP3 Transcription factor staining buffer eBioscience 00-5523-00
H2 (IAb) -FITC Biolegend 114406 clone AF6-120.1
hrIL-2 Chiron Corp
Ionomycin Sigma I0634
LD Columns Miltenyi Biotec 130-042-901
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401
MACS buffer (MB) in house 0.5% Bovine Serum Albumin (BSA; Sigma-Aldrich) and 2Mm EDTA
MS Columns Miltenyi Biotec 130-042-201
Non-essential amino acids Gibco 11140-035
Penicillin and streptomycin (Pen-Strep) Lonza 15140-122
PermWash BD Bioscience 51-2091KZ
PFA Sigma P6148
Phosphate buffered saline (PBS) EuroClone ECB4004L
PMA Sigma P1585
Pre-Separation Filters (30 µm) Miltenyi Biotec 130-041-407
Recombinat Mouse IL-7 R&D System 407-ML-025
RPMI 1640 with glutamax Gibco 61870-010
sodium pyruvate Gibco 11360-039
TCRβ -APC Biolegend 109212 clone H57-597
αCD3CD28 mouse T activator Dynabeads Gibco 11452D
β-mercaptoethanol Gibco 31350010

References

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Cite This Article
Delfanti, G., Perini, A., Zappa, E., Fedeli, M. Purification and Expansion of Mouse Invariant Natural Killer T Cells for in vitro and in vivo Studies. J. Vis. Exp. (168), e62214, doi:10.3791/62214 (2021).

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