Summary

Purificazione ed espansione di cellule T Natural Killer invarianti di topo per studi in vitro e in vivo

Published: February 15, 2021
doi:

Summary

Descriviamo un protocollo rapido e robusto per arricchire le cellule T natural killer invarianti (iNKT) dalla milza di topo ed espanderle in vitro a numeri adatti per studi in vitro e in vivo.

Abstract

Le cellule Invariant Natural Killer T (iNKT) sono linfociti T innata che esprimono un recettore delle cellule T semi-invariante (TCR) conservato specifico per antigeni lipidici auto o microbici presentati dalla molecola non polimorfica MHC di classe I CD1d. Studi preclinici e clinici supportano un ruolo delle cellule iNKT nel cancro, nell’autoimmunità e nelle malattie infettive. Le cellule iNKT sono molto conservate in tutte le specie e la loro indagine è stata facilitata da modelli murini, tra cui topi cd1d-carenti o iNKT-carenti, e la possibilità di rilevarle inequivocabilmente in topi e uomini con tetrameri CD1d o mAbs specifici per il TCR semi-invariante. Tuttavia, le cellule iNKT sono rare e devono essere espanse per raggiungere numeri gestibili per qualsiasi studio. Poiché la generazione della linea cellulare iNKT di topo primario in vitro si è dimostrata difficile, abbiamo istituito un protocollo robusto per purificare ed espandere le cellule iNKT spleniche dai topi transgenici iVα14-Jα18 (iVα14Tg), in cui le cellule iNKT sono 30 volte più frequenti. Mostriamo qui che le cellule iNKT iVα14Tg miliniche primarie possono essere arricchite attraverso un processo di separazione immunomagnetica, producendo circa il 95-98% di cellule iNKT pure. Le cellule iNKT purificate sono stimolate da perline anti-CD3 / CD28 più IL-2 e IL-7, con conseguente espansione di 30 volte al giorno +14 della coltura con purezza dell’85-99%. Le cellule iNKT espanse possono essere facilmente manipolate geneticamente, fornendo uno strumento inestimabile per sezionare i meccanismi di attivazione e funzione in vitro e, soprattutto, anche dopo il trasferimento adottivo in vivo.

Introduction

Le cellule T natural killer invarianti (cellule iNKT) sono linfociti T innati che esprimono un recettore semi-invariante delle cellule T αβ (TCR), formato nei topi da una catena Vα14-Jα18 invariante accoppiata con un insieme limitato di diverse catene Vβ1, che è specifico per gli antigeni lipidici presentati dalla molecola correlata alla classe I MHC CD1d2. Le cellule iNKT subiscono un programma di selezione agonista con conseguente acquisizione di un fenotipo effettore attivato/innato già presente nel timo, che avviene attraverso diversi stadi di maturazione3,4,producendo un sottoinsieme CD4+ ecd4- sottoinsieme. Attraverso questo programma, le cellule iNKT acquisiscono fenotipi effettrici T helper (TH) distinti, vale a dire TH1 (iNKT1), TH2 (iNKT2) e TH17 (iNKT17), identificabili dall’espressione dei fattori di trascrizione T-bet, GATA3, PLZF e RORγt, rispettivamente5. Le cellule iNKT riconoscono una serie di lipidi microbici ma sono anche autoreattive nei confronti dei lipidi endogeni che sono sovraregolati nel contesto di situazioni patologiche di stress cellulare e danno tissutale, come il cancro e l’autoimmunità2. Al momento dell’attivazione, le cellule iNKT modulano le funzioni di altre cellule effettrici immunitarie innate e adattative attraverso il contatto diretto e la produzione di citochine2.

Le indagini sulle cellule iNKT sono state facilitate da modelli murini, tra cui topi cd1d-deficienti o Jα18-carenti, e dalla produzione di tetrameri CD1d caricati con antigene più la generazione di anticorpi monoclonali (mAbs) specifici per il TCR semi-invariante umano. Tuttavia, la generazione della linea cellulare iNKT del topo primario si è dimostrata difficile. Per caratterizzare meglio le funzioni antitumorali delle cellule iNKT e utilizzarle per la terapia cellulare adottiva, abbiamo istituito un protocollo per purificare ed espandere le cellule iNKT spleniche di topi transgenici iVα14-Jα18 (iVα14Tg)6, in cui le cellule iNKT sono 30 volte più frequenti rispetto ai topi wild type.

Le cellule iNKT espanse possono essere sfruttate per saggi in vitro e in vivo al momento del trasferimento nei topi. In questo contesto, ad esempio, abbiamo mostrato i loro potenti effettiantitumorali 7. Inoltre, le cellule iNKT espanse in vitro sono suscettibili di modificazione funzionale tramite trasferimento genico o modifica prima della loro iniezione in vivo8, consentendo un’analisi funzionale approfondita dei percorsi molecolari, oltre a spianare la strada a terapie cellulari avanzate.

Protocol

Le procedure qui descritte sono state esaminate e approvate dal Comitato Istituzionale per la Cura e l’Uso degli Animali (IACUC) (n. 1048) dell’Istituto Scientifico San Raffaele. NOTA: Tutte le procedure devono essere eseguite in condizioni sterili. Tutti i reagenti utilizzati sono elencati nella Tabella dei Materiali. 1. Lavorazione della milza Eutanasia dei topi iVα14-Jα18 per inalazione di CO2 secondo la politica istituzion…

Representative Results

Il protocollo descritto in questo manoscritto consente di arricchire le cellule iNKT dalla milza di topi transgenici iVa14-Ja18 attraverso un processo di separazione immunomagnetica riassunto in Figura 1A. Le cellule T della milza totale vengono prima selezionate negativamente esaurendo le cellule B e i monociti, seguite dallo smistamento immunomagnetico positivo delle cellule iNKT con tetrameri CD1d caricati con antigene lipidico PBS-57, che consentono di colorare specificamente solo le cel…

Discussion

Qui mostriamo un protocollo riproducibile e fattibile per ottenere milioni di celle iNKT pronte all’uso. A causa della scarsità di queste cellule in vivo, era altamente necessario un metodo per espanderle. Il protocollo che proponiamo non richiede né una particolare strumentazione né un elevato numero di topi. Abbiamo sfruttato i topi transgenici iVα14-Jα18 di proposito per ridurre il numero di topi necessari per la procedura.

Un altro protocollo di successo per l’espansione cellulare iNK…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo Paolo Dellabona e Giulia Casorati per il supporto scientifico e la lettura critica del manoscritto. Ringraziamo anche il NIH Tetramer Core Facility per il tetramero CD1d del topo. Lo studio è stato finanziato dalla Fondazione Cariplo Grant 2018-0366 (a M.F.) e dalla borsa di studio 2019-22604 dell’Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC) (a G.D.).

Materials

Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) solution in house 0.15M NH4Cl, 10mM KHCO3, 0.1mM EDTA, pH 7.2-7.4
anti-FITC Microbeads Miltenyi Biotec 130-048-701
anti-PE Microbeads Miltenyi Biotec 130-048-801
Brefeldin A Sigma B6542
CD19 -FITC Biolegend 115506 clone 6D5
CD1d-tetramer -PE NIH tetramer core facility mouse PBS57-Cd1d-tetramers
CD4 -PeCy7 Biolegend 100528 clone RM4-5
Fc blocker BD Bioscience 553142
Fetal Bovine Serum (FBS) Euroclone ECS0186L heat-inactivated and filtered .22 before use
FOXP3 Transcription factor staining buffer eBioscience 00-5523-00
H2 (IAb) -FITC Biolegend 114406 clone AF6-120.1
hrIL-2 Chiron Corp
Ionomycin Sigma I0634
LD Columns Miltenyi Biotec 130-042-901
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401
MACS buffer (MB) in house 0.5% Bovine Serum Albumin (BSA; Sigma-Aldrich) and 2Mm EDTA
MS Columns Miltenyi Biotec 130-042-201
Non-essential amino acids Gibco 11140-035
Penicillin and streptomycin (Pen-Strep) Lonza 15140-122
PermWash BD Bioscience 51-2091KZ
PFA Sigma P6148
Phosphate buffered saline (PBS) EuroClone ECB4004L
PMA Sigma P1585
Pre-Separation Filters (30 µm) Miltenyi Biotec 130-041-407
Recombinat Mouse IL-7 R&D System 407-ML-025
RPMI 1640 with glutamax Gibco 61870-010
sodium pyruvate Gibco 11360-039
TCRβ -APC Biolegend 109212 clone H57-597
αCD3CD28 mouse T activator Dynabeads Gibco 11452D
β-mercaptoethanol Gibco 31350010

References

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Delfanti, G., Perini, A., Zappa, E., Fedeli, M. Purification and Expansion of Mouse Invariant Natural Killer T Cells for in vitro and in vivo Studies. J. Vis. Exp. (168), e62214, doi:10.3791/62214 (2021).

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