Uyuyan Güzel (SB) transpozon sistemini kullanarak pigment epitel türevi faktörü (PEDF) kodlayan gen ile elektroporasyon yoluyla primer insan pigment epitel hücrelerini transfekte etmek için bir protokol geliştirdik. Başarılı transfeksiyon, kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR), immünoblotlama ve enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) ile gösterilmiştir.
Giderek yaşlanan toplumumuz, nörodejeneratif hastalıkların artan insidansına yol açmaktadır. Şimdiye kadar, patolojik mekanizmalar yeterince anlaşılmamış, bu nedenle tanımlanmış tedavilerin kurulmasını engellemiştir. Koruyucu bir faktörün artan ekspresyonu için hücre bazlı katkı gen tedavileri, yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) gibi nörodejeneratif hastalıkları tedavi etmek için umut verici bir seçenek olarak kabul edilir. Sinir sisteminde nöroprotektif ve anti-anjiyojenik bir protein olarak karakterize edilen pigment epitel kaynaklı faktörü (PEDF) kodlayan genin, Uyuyan Güzel (SB) transpozon sistemini kullanarak primer insan pigment epitel (PE) hücrelerinin genomuna stabil ekspresyonu için bir yöntem geliştirdik. Primer PE hücreleri insan donör gözlerinden izole edildi ve kültürde tutuldu. Birleşmeye ulaştıktan sonra, 11 μL resüspansiyon tamponunda 1 x 104 hücre askıya alındı ve 30 ng hiperaktif SB (SB100X) transpozaz plazmidi ve 470 ng PEDF transpozon plazmidi içeren 2 μL saflaştırılmış bir çözelti ile birleştirildi. Genetik modifikasyon, aşağıdaki parametreler kullanılarak kılcal bir elektroporasyon sistemi ile gerçekleştirildi: 1.100 V voltajlı ve 20 ms genişliğinde iki darbe. Transfekte hücreler, fetal sığır serumu ile desteklenmiş ortam içeren kültür plakalarına aktarıldı; antibiyotikler ve antimikotikler ilk orta değişim ile eklendi. Başarılı transfeksiyon bağımsız olarak yapılan deneylerde gösterilmiştir. Kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR), PEDF transgeninin artmış ekspresyonunu gösterdi. PEDF sekresyonu, immünoblotlama ile değerlendirildiği ve enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) ile ölçüldüğü gibi anlamlı derecede yükselmiş ve stabil kalmıştır. SB100X aracılı transfer, PE hücrelerinin genomuna stabil bir PEDF gen entegrasyonuna izin verdi ve AMD veya diğer retinal dejeneratif hastalıkları tedavi etmek için hücre bazlı bir gen ekleme tedavisinin geliştirilmesi için kritik olan PEDF’nin sürekli salgılanmasını sağladı. Dahası, PEDF transpozonunun insan PE hücrelerine entegrasyon profilinin analizi, neredeyse rastgele bir genomik dağılım olduğunu göstermiştir.
İleri yaş, nörodejeneratif hastalıklar için ana risk olarak tanımlanmaktadır. 60 yaşından büyük hastalarda ciddi görme kaybına yol açan poligenik bir hastalık olan yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD), körlük ve görme bozukluğunun en yaygın dört nedenine aittir1 ve 2040 yılında 288 milyon kişiye yükselmesi beklenmektedir2. Koryokapillaris ve retinal fotoreseptörler arasında sıkıca paketlenmiş hücrelerin tek bir tabakası olan retinal pigment epitelinin (RPE) disfonksiyonları, AMD’nin patogenezine katkıda bulunur. RPE, normal bir retina fonksiyonu3 için gerekli olan birçok görevi yerine getirir ve retinanın ve koryokapilarisin yapısal bütünlüğünü korumak için gerekli olan çeşitli büyüme faktörlerini ve faktörlerini salgılar, böylece fotoreseptör sağkalımını destekler ve dolaşım ve besin tedariki için bir temel sağlar.
Sağlıklı gözlerde, pigment epitel kaynaklı faktör (PEDF), vasküler endotelyal büyüme faktörünün (VEGF) etkilerini dengelemekten sorumludur ve nöronları apoptoza karşı korur, endotel hücre proliferasyonunu önler ve kılcal endoteli stabilize eder. Değişmiş bir VEGF-PEDF oranı, hayvan modelleri 4,5’te ve AMD ve proliferatif diyabetik retinopatiye bağlı koroidal neovaskülarizasyon (CNV) olan hastaların örneklerinde gözlenen oküler neovaskülarizasyon ile ilişkilidir 6,7,8,9,10 . Gelişmiş VEGF konsantrasyonu, mevcut standart tedavinin hedefidir. Anti-VEGF farmasötikler bevacizumab, ranibizumab, aflibercept ve en son brolucizumab CNV hastalarının yaklaşık üçte birinde görme keskinliğini arttırır veya vakaların% 90’ında görmeyi stabilize eder11,12,13. Bununla birlikte, sıklıkla, genellikle aylık intravitreal enjeksiyonlar, advers olay riski taşır14, hasta uyumunu bozar ve sağlık sistemleri için önemli bir ekonomik yük oluşturur15. Ayrıca, hastaların belirli bir yüzdesi (% 2-% 20) anti-VEGF tedavisine cevap vermemekte veya sadece zayıf tepki vermektedir16,17,18,19. Bu negatif eşlik edenler, göz içi implantlar, hücre ve/veya gen terapötik yaklaşımlar gibi alternatif tedavilerin geliştirilmesini gerektirmektedir.
Gen terapisi, kalıtsal ve kalıtsal olmayan hastalıklar için umut verici bir tedavi olarak gelişmiştir ve fonksiyonel olmayan gen dizilerini restore etmeyi veya arızalı olanları bastırmayı amaçlamaktadır. Etken faktörlerin tanımlanması ve değiştirilmesinin pek mümkün olmadığı poligenik hastalıklar için, stratejiler koruyucu bir faktörün sürekli olarak verilmesini amaçlamaktadır. AMD durumunda, endostatin ve anjiyostatin20’nin kararlı ekspresyonu, VEGF antagonisti çözünür fms benzeri tirozin kinaz-1 (sFLT-1) 21,22, farklılaşmanın tamamlayıcı düzenleyici protein kümesi 59 (CD59)23 veya PEDF24,25 gibi çeşitli katkı tedavileri geliştirilmiştir. . Göz ve özellikle retina, kapalı yapısı, iyi erişilebilirliği, küçük boyutu ve bağışıklık ayrıcalığı nedeniyle gen bazlı bir ilaç için mükemmel bir hedeftir, böylece düşük terapötik dozların lokalize bir şekilde verilmesine izin verir ve nakillerin reddedilmeye daha az duyarlı hale getirilmesine izin verir. Ayrıca, göz non-invaziv izlemeye olanak tanır ve retina farklı görüntüleme teknikleri ile incelenebilir.
Viral vektörler, yüksek transdüksiyon verimlilikleri nedeniyle, terapötik genleri hedef hücrelere iletmek için ana araçtır. Bununla birlikte, kullanılan viral vektöre bağlı olarak, immün ve inflamatuar yanıtlar26, mutajenik ve onkojenik etkiler 27,28 veya diğer dokularda yayılma29 gibi farklı advers reaksiyonlar tanımlanmıştır. Pratik sınırlamalar arasında sınırlı bir ambalaj boyutu30’un yanı sıra31,32 klinik sınıf lotlarının üretimi ile ilgili zorluklar ve maliyetler bulunmaktadır. Bu dezavantajlar, lipo / polipleksler, ultrason veya elektroporasyon yoluyla aktarılan viral olmayan, plazmid bazlı vektörlerin daha da geliştirilmesini teşvik etmiştir. Bununla birlikte, transgenin konakçı genomuna genomik entegrasyonu genellikle plazmid vektörleri ile desteklenmez, böylece geçici bir ekspresyon ile sonuçlanır.
Transpozonlar, genom içindeki konumlarını değiştiren doğal olarak oluşan DNA fragmanlarıdır, bu da gen terapisi için benimsenmiş bir özelliktir. Aktif bir entegrasyon mekanizması nedeniyle, transpozon tabanlı vektör sistemleri, yerleştirilen transgenin sürekli ve sabit bir ifadesine izin verir. Uyuyan Güzel (SB) transpozonu, balık33’te bulunan eski bir Tc1 / denizci tipi transpozondan yeniden oluşturulmuş ve hiperaktif varyant SB100X34 ile sonuçlanan moleküler evrimle daha da geliştirilmiş, çeşitli birincil hücrelerde verimli transpozisyon sağlamıştır ve farklı hastalık modellerinde fenotipik düzeltme için kullanılmıştır35. Şu anda, SB transpozon sistemi kullanılarak 13 klinik çalışma başlatılmıştır. SB100X transpozon sistemi iki bileşenden oluşur: terminal ters çevrilmiş tekrarlar (TIR’lar) tarafından kuşatılan ilgi genini içeren transpozon ve transpozonu harekete geçiren transpozaz. Plazmid DNA’sının hücrelere verilmesini takiben, transpozaz TIR’ları bağlar ve transpozonun eksizyonunu ve hücrenin genomuna entegrasyonunu katalize eder.
Neovasküler AMD tedavisi için viral olmayan hücre bazlı bir katkı maddesi tedavisi geliştirdik. Yaklaşım, PEDF geninin SB100X transpozon sistemi 36,37,38 aracılığıyla primer pigment epitel (PE) hücrelerine elektroporasyon bazlı yerleştirilmesini içerir. Transpozaz ve PEDF’nin genetik bilgisi ayrı plazmidler üzerinde sağlanır, böylece ideal SB100X-PEDF transpozon oranının ayarlanmasını sağlar. Elektroporasyon, yüzey alanlarını en aza indirirken elektrotlar arasında maksimum boşluk boyutu ile karakterize edilen pipet bazlı bir kılcal transfeksiyon sistemi kullanılarak gerçekleştirilir. Cihazın çok çeşitli memeli hücrelerinde mükemmel transfeksiyon oranları elde ettiği gösterilmiştir 39,40,41. Küçük elektrot yüzey alanı düzgün bir elektrik alanı sağlar ve elektroliz42’nin çeşitli yan etkilerini azaltır.
Transfekte pigment epitel hücreleri tarafından salgılanan PEDF’nin anti-anjiyojenik işlevselliği, insan göbek damarı endotel hücrelerinin filizlenme, göç ve apoptozunu analiz eden çeşitli in vitro deneylerde gösterilmiştir43. Ek olarak, kornea neovaskülarizasyonunun tavşan modelinde PEDF-transfekte hücrelerin transplantasyonu44 ve CNV 43,45,46’nın sıçan modelinde neovaskülarizasyonun azaldığını göstermiştir.
Burada, kılcal transfeksiyon sistemi kullanarak SB100X transpozon sistemi aracılığıyla PEDF geninin birincil insan RPE hücrelerine kararlı bir şekilde yerleştirilmesi için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır. Transfekte edilen hücreler 21 gün boyunca kültürde tutuldu ve daha sonra kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) ile PEDF gen ekspresyonu ve immünoblotasyon ve enzime bağlı immünosorbent testi ile PEDF protein sekresyonu açısından analiz edildi (ELISA, Şekil 1).
Projemizde, transfekte edilen hücrelerin koruyucu bir ortamın kurulması ve sürdürülmesi için uzun süreli terapötik olarak kullanılması amacıyla sürekli olarak aşırı eksprese edilen ve etkili bir faktör salgılayan genetiği değiştirilmiş primer RPE hücrelerinin viral olmayan üretimini hedefliyoruz. Anti-anjiyojenik ve nöroprotektif fonksiyonlara sahip, her yerde eksprese edilen çok fonksiyonlu bir protein olan PEDF’yi kodlayan genin tanıtımını yaptık. Burada açıklanan protokol, SB100X</…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, Avrupa Birliği’nin araştırma, teknolojik geliştirme ve gösterim için Yedinci Çerçeve Programı, 305134 no’lu hibe anlaşması ile desteklenmiştir. Zsuzsanna Izsvák, Avrupa Araştırma Konseyi, ERC Advanced (ERC-2011-ADG 294742) tarafından finanse edildi. Yazarlar, mükemmel teknik destek için Anna Dobias ve Antje Schiefer’e (Oftalmoloji Bölümü, Üniversite Hastanesi RWTH Aachen) ve insan donör gözlerini sağladıkları için Aachen Cornea Bank’a (Oftalmoloji Bölümü, Üniversite Hastanesi RWTH Aachen) teşekkür eder.
Isolation of primary human RPE cells | |||
24-Well Cell Culture Plate | Eppendorf, Hamburg, Germany | 0030722019 | |
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB) | Merck, Darmstadt, Germany | A2942 | |
Colibri Forceps | Geuder, Heidelberg, Germany | G-18950 | |
Curved Iris Forceps | Geuder, Heidelberg, Germany | G-18856 | |
Disposable Scalpel (No. 11) | Feather, Osaka, Japan | ||
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P04-41150 | |
Extra Fine Pointed Eye Scissor | Geuder, Heidelberg, Germany | G-19405 | |
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P40-37500 | |
Glass Pasteur Pipettes | Brand, Wertheim, Germany | 747715 | |
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep) | Merck, Darmstadt, Germany | P0781 | |
Pipette Tips (1000 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
Single Channel Pipette (100-1000 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Sterile Drape | Lohmann & Rauscher, Rengsdorf, Germany | ||
Sterile Gauze Compress | Fink-Walter, Merchweiler, Germany | 321063 | |
Sterile Gloves | Sempermed, Wien, Austria | ||
Sterile Petri Dish (Falcon 60 mm x 15 mm) | Corning, Corning, NY | 351007 | |
Sterile Surgical Gown | Halyard Health, Alpharetta, GA | ||
Straight Iris Forceps | Geuder, Heidelberg, Germany | G-18855 | |
Electroporation of primary human RPE cells | |||
10 mM Tris-HCl (pH 8.5) | |||
12-Well Cell Culture Plate | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 150628 | |
24-Well Cell Culture Plate | Eppendorf, Hamburg, Germany | 0030722019 | |
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB) | Merck, Darmstadt, Germany | A2942 | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P04-41150 | |
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P40-37500 | |
Inverted Microscope | Leica Mikrosysteme, Wetzlar, Germany | Leica DMi8 | |
Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | ||
Capillary Transfection System (Neon Transfection System) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | MPK5000 | |
Neon Transfection System 10 µL Kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | MPK1096 | |
Hemocytometer (Neubauer Chamber) | Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany | 0640110 | |
PBS Dulbecco w/o Ca2+ w/o Mg2+ | Biochrom, Berlin, Germany | L182-50 | |
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep) | Merck, Darmstadt, Germany | P0781 | |
Pipette Tips (10 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
Pipette Tips (1000 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
Pipette Tips (200 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
Plasmid Maxi Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 12163 | |
Single Channel Pipette (0.1-10 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Single Channel Pipette (100-1000 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Single Channel Pipette (10-200 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Trypan Blue Solution | Merck, Darmstadt, Germany | T8154 | |
Trypsin-EDTA (0,05 %) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 25300054 | |
Analyses of transfected primary human RPE cells | |||
10% SDS-Polyacrylamide Gel | |||
1x Incubation Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0) | |||
2x SDS Sample Buffer | |||
4x Incubation Buffer (200 mM NaH2PO4, 1.2 M NaCl, 40 mM imidazole, pH 8.0) | |||
Amersham Protran Supported 0.2 µm Nitrocellulose Blotting Membrane | Cytiva, Marlborough, MA | 10600015 | |
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB) | Merck, Darmstadt, Germany | A2942 | |
Anti-PEDF Antibodies (Rabbit Polyclonal) | BioProducts, Middletown, MD | AB-PEDF1 | |
Anti-Penta-His Antibodies (Mouse Monoclonal) | Qiagen, Hilden, Germany | 34660 | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P04-41150 | |
Elution Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8.0) | |||
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P40-37500 | |
Hemocytometer (Neubauer Chamber) | Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany | 0640110 | |
Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Mouse Antibodies (Rabbit Polyclonal) | Agilent Dako, Santa Clara, CA | P0260 | |
Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Rabbit Antibodies (Goat Polyclonal) | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab6721 | |
Human PEDF ELISA Kit | BioProducts, Middletown, MD | PED613 | |
LAS-3000 Imaging System | Fujifilm, Minato, Japan | ||
LightCycler 1.2 Instrument | Roche Life Science, Penzberg, Germany | ||
LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I | Roche Life Science, Penzberg, Germany | 12239264001 | |
LightCycler Capillaries (20 μl) | Roche Life Science, Penzberg, Germany | 4929292001 | |
Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | ||
Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Module | Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany | 1658015 | |
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel | Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany | 1658004 | |
Ni-NTA Superflow | Qiagen, Hilden, Germany | 30410 | |
PageRuler Prestained Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 26616 | |
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep) | Merck, Darmstadt, Germany | P0781 | |
Pipette Tips (10 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
Pipette Tips (1000 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
Pipette Tips (200 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany | 1645050 | |
QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 51304 | |
Reverse Transcription System | Promega, Madison, WI | A3500 | |
RNase-Free DNase Set | Qiagen, Hilden, Germany | 79254 | |
RNeasy Mini Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | |
Rocking Shaker | Cole-Parmer, Staffordshire, United Kingdom | SSM3 | |
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (2.0 mL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Single Channel Pipette (0.1-10 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Single Channel Pipette (100-1000 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Single Channel Pipette (10-200 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Trans-Blot Turbo Transfer System | Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany | 1704150 | |
Trypan Blue Solution | Merck, Darmstadt, Germany | T8154 | |
Trypsin-EDTA (0,05 %) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 25300054 |