لقد طورنا بروتوكولا لنقل الخلايا الظهارية الصبغية البشرية الأولية عن طريق التثقيب الكهربائي باستخدام عامل مشتق من ظهارة الصباغ المشفر للجين (PEDF) باستخدام نظام ترانسبوزون Sleeping Beauty (SB). تم إثبات النقل الناجح من خلال تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي (qPCR) ، والنشاف المناعي ، ومقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA).
يؤدي مجتمعنا المسن بشكل متزايد إلى تزايد حالات الأمراض التنكسية العصبية. حتى الآن ، لا يتم فهم الآليات المرضية بشكل كاف ، مما يعوق إنشاء علاجات محددة. تعتبر العلاجات الجينية المضافة القائمة على الخلايا لزيادة التعبير عن عامل وقائي خيارا واعدا لعلاج الأمراض التنكسية العصبية ، مثل الضمور البقعي المرتبط بالعمر (AMD). لقد طورنا طريقة للتعبير المستقر للعامل المشتق من ظهارة الصباغ المشفر للجين (PEDF) ، والذي يتميز بأنه بروتين وقائي عصبي ومضاد لتولد الأوعية في الجهاز العصبي ، في جينوم الخلايا الظهارية الصباغية البشرية الأولية (PE) باستخدام نظام ترانسبوزون الجمال النائم (SB). تم عزل خلايا PE الأولية من عيون المتبرعين البشريين والحفاظ عليها في الثقافة. بعد الوصول إلى نقطة التقاء ، تم تعليق 1 × 104 خلايا في 11 ميكرولتر من المخزن المؤقت لإعادة التعليق ودمجها مع 2 ميكرولتر من محلول نقي يحتوي على 30 نانوغرام من بلازميد ترانسبوزاز SB (SB100X) مفرط النشاط و 470 نانوغرام من بلازميد ترانسبوزون PEDF. تم إجراء التعديل الوراثي باستخدام نظام التثقيب الكهربائي الشعري باستخدام المعلمات التالية: نبضتان بجهد 1100 فولت وعرض 20 مللي ثانية. تم نقل الخلايا المنقولة إلى ألواح استزراع تحتوي على وسط مكمل بمصل بقري جنيني. تمت إضافة المضادات الحيوية ومضادات الميكروبات مع أول تبادل متوسط. تم إثبات النقل الناجح في التجارب التي أجريت بشكل مستقل. أظهر تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي (qPCR) زيادة التعبير عن جين التحوير PEDF. كان إفراز PEDF مرتفعا بشكل ملحوظ وظل مستقرا ، كما تم تقييمه بواسطة النشاف المناعي ، وتم قياسه كميا بواسطة مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA). سمح النقل بوساطة SB100X بتكامل جين PEDF مستقر في جينوم خلايا PE وضمن الإفراز المستمر ل PEDF ، وهو أمر بالغ الأهمية لتطوير علاج إضافة الجينات القائم على الخلايا لعلاج AMD أو الأمراض التنكسية الأخرى في شبكية العين. علاوة على ذلك ، أشار تحليل ملف تعريف تكامل ترانسبوزون PEDF في خلايا PE البشرية إلى توزيع جينومي عشوائي تقريبا.
يوصف التقدم في العمر بأنه الخطر الرئيسي للأمراض التنكسية العصبية. التنكس البقعي المرتبط بالعمر (AMD) ، وهو مرض متعدد الجينات يؤدي إلى فقدان البصر الشديد لدى المرضى الذين تزيد أعمارهم عن 60 عاما ، ينتمي إلى الأسباب الأربعة الأكثر شيوعا للعمى وضعف البصر1 ومن المتوقع أن يرتفع إلى 288 مليون شخص في عام 20402. تساهم اختلالات ظهارة الصباغ الشبكية (RPE) ، وهي طبقة واحدة من الخلايا المعبأة بإحكام تقع بين المشيمية والمستقبلات الضوئية للشبكية ، في التسبب في AMD. يؤدي RPE مهام متعددة ضرورية لوظيفة الشبكية الطبيعية3 ويفرز مجموعة متنوعة من عوامل النمو والعوامل الأساسية للحفاظ على السلامة الهيكلية للشبكية والمشيمية الشعرية ، وبالتالي دعم بقاء المستقبلات الضوئية وتوفير أساس للدورة الدموية وإمدادات المواد الغذائية.
في العيون السليمة ، العامل المشتق من ظهارة الصباغ (PEDF) مسؤول عن موازنة تأثيرات عامل نمو بطانة الأوعية الدموية (VEGF) ويحمي الخلايا العصبية من موت الخلايا المبرمج ، ويمنع تكاثر الخلايا البطانية ، ويثبت البطانة الشعرية. ترتبط نسبة VEGF إلى PEDF المتغيرة بالأوعية الدموية الجديدة للعين ، والتي لوحظت في النماذج الحيوانية 4,5 وكذلك في عينات من المرضى الذين يعانون من الأوعية الدموية المشيمية (CNV) بسبب AMD واعتلال الشبكية السكري التكاثري6،7،8،9،10 . تركيز VEGF المعزز هو الهدف للعلاج القياسي الحالي. تعمل الأدوية المضادة ل VEGF بيفاسيزوماب ورانيبيزوماب وأفليبيرسيبت ومؤخرا برولوسيزوماب على تحسين حدة البصر في حوالي ثلث مرضى CNV أو بالأحرى تثبيت الرؤية في 90٪ من الحالات11،12،13. ومع ذلك ، فإن الحقن داخل الجسم الزجاجي المتكررة ، وغالبا ما تكون شهرية ، تحمل مخاطر الأحداث الضائرة14 ، وتضعف امتثال المريض ، وتمثل عبئا اقتصاديا كبيرا على أنظمة الرعاية الصحية15. علاوة على ذلك ، فإن نسبة معينة من المرضى (2٪ -20٪) لا يستجيبون أو يتفاعلون بشكل سيئ فقط مع العلاج المضاد ل VEGF16،17،18،19. تتطلب هذه المصاحبة السلبية تطوير علاجات بديلة ، على سبيل المثال ، الغرسات داخل العين ، والنهج العلاجية الخلوية و / أو الجينية.
تطور العلاج الجيني كعلاج واعد للأمراض الوراثية وغير الوراثية ويهدف إلى استعادة تسلسل الجينات غير الوظيفية أو قمع التسلسلات المعطلة. بالنسبة للأمراض متعددة الجينات ، حيث يصعب تحديد العوامل المسببة واستبدالها ، تهدف الاستراتيجيات إلى التسليم المستمر لعامل الحماية. في حالة AMD ، تم تطوير العديد من العلاجات المضافة ، مثل التعبير المستقر عن الإندوستاتين والأنجيوستاتين 20 ، ومضاد VEGF القابل للذوبان مثل التيروزين كيناز -1 (sFLT-1) 21،22 ، ومجموعة البروتين التنظيمية التكميلية للتمايز 59 (CD59) 23 أو PEDF24,25 . تعد العين ، وخاصة شبكية العين ، هدفا ممتازا للأدوية القائمة على الجينات بسبب البنية المغلقة ، وسهولة الوصول ، وصغر حجمها ، وامتيازها المناعي ، مما يسمح بالتسليم الموضعي لجرعات علاجية منخفضة ويجعل عمليات الزرع أقل عرضة للرفض. علاوة على ذلك ، تتيح العين المراقبة غير الغازية ، ويمكن فحص شبكية العين بواسطة تقنيات تصوير مختلفة.
النواقل الفيروسية هي ، بسبب كفاءتها العالية في النقل ، الوسيلة الرئيسية لتوصيل الجينات العلاجية إلى الخلايا المستهدفة. ومع ذلك ، اعتمادا على الناقل الفيروسي المستخدم ، تم وصف ردود فعل سلبية مختلفة ، مثل الاستجابات المناعية والالتهابية26 ، والتأثيرات المطفرة والمسرطنة 27,28 ، أو الانتشار في الأنسجة الأخرى29. تشمل القيود العملية حجم العبوةالمقيد 30 بالإضافة إلى الصعوبات والتكاليف المرتبطة بإنتاج مجموعات الصفالسريري 31,32. وقد عززت هذه العيوب زيادة تطوير النواقل غير الفيروسية القائمة على البلازميد التي يتم نقلها عن طريق ليبو-/بوليبلكس، الموجات فوق الصوتية أو التثقيب الكهربائي. ومع ذلك ، لا يتم عادة تعزيز التكامل الجيني للجين المحوري في الجينوم المضيف مع ناقلات البلازميد ، مما يؤدي إلى تعبير عابر.
الترانسبوزونات هي شظايا الحمض النووي التي تحدث بشكل طبيعي والتي تغير موقعها داخل الجينوم ، وهي خاصية تم تبنيها للعلاج الجيني. نظرا لآلية التكامل النشطة ، تسمح أنظمة النواقل القائمة على الترانسبوزون بالتعبير المستمر والمستمر عن جين التحوير المدرج. إن ترانسبوزون الجمال النائم (SB) ، الذي أعيد تشكيله من ترانسبوزون قديم من نوع Tc1 / مارينر موجود في الأسماك33 وتم تحسينه بشكل أكبر من خلال التطور الجزيئي مما أدى إلى متغير فرط النشاط SB100X34 ، مكن من النقل الفعال في الخلايا الأولية المختلفة واستخدم لتصحيح النمط الظاهري في نماذج الأمراض المختلفة35. في الوقت الحاضر ، تم بدء 13 تجربة سريرية باستخدام نظام SB transposon. يتكون نظام الترانسبوزون SB100X من مكونين: الترانسبوزون ، الذي يتألف من الجين محل الاهتمام المحاط بالتكرارات المقلوبة الطرفية (TIRs) ، والترانسبوزاز ، الذي يحشد الترانسبوزون. بعد توصيل الحمض النووي البلازميد إلى الخلايا ، يربط الترانسبوزاز TIRs ويحفز استئصال ودمج الترانسبوزون في جينوم الخلية.
لقد قمنا بتطوير علاج مضاف غير فيروسي قائم على الخلايا لعلاج AMD الوعائي الجديد. يشتمل النهج على إدخال جين PEDF القائم على التثقيب الكهربائي في الخلايا الظهارية الصبغية الأولية (PE) عن طريق نظام ترانسبوزون SB100X 36،37،38. يتم توفير المعلومات الوراثية ل transposase و PEDF على بلازميدات منفصلة ، مما يتيح تعديل نسبة الترانسبوزون SB100X إلى PEDF المثالية. يتم إجراء التثقيب الكهربائي باستخدام نظام نقل شعري قائم على الماصة يتميز بحجم فجوة كبير بين الأقطاب الكهربائية مع تقليل مساحة سطحها. وقد تبين أن الجهاز يحقق معدلات نقل ممتازة في مجموعة واسعة من خلايا الثدييات39،40،41. توفر مساحة سطح القطب الصغير مجالا كهربائيا موحدا وتقلل من الآثار الجانبية المختلفة للتحليل الكهربائي42.
تم عرض الوظيفة المضادة لتولد الأوعية الدموية ل PEDF التي تفرزها الخلايا الظهارية الصبغية المنقولة في تجارب مختلفة في المختبر تحلل نبتة وهجرة وموت الخلايا المبرمج للخلايا البطانية الوريدية السرية البشرية43. بالإضافة إلى ذلك ، أظهر زرع الخلايا المنقولة PEDF في نموذج أرنب من الأوعية الدموية القرنية44 بالإضافة إلى نموذج الفئران من CNV43،45،46 انخفاضا في الأوعية الدموية الجديدة.
هنا ، نصف بروتوكولا مفصلا للإدخال المستقر لجين PEDF في خلايا RPE البشرية الأولية عبر نظام transposon SB100X باستخدام نظام نقل الشعيرات الدموية. تم الاحتفاظ بالخلايا المنقولة في المزرعة لمدة 21 يوما وتم تحليلها لاحقا من حيث التعبير الجيني PEDF عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) ومن حيث إفراز بروتين PEDF عن طريق النشاف المناعي ومقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA ، الشكل 1).
في مشروعنا ، نهدف إلى الإنتاج غير الفيروسي لخلايا RPE البشرية الأولية المعدلة وراثيا والتي تفرط باستمرار في التعبير عن عامل فعال وتفرز من أجل استخدام الخلايا المنقولة كعلاج طويل الأجل لإنشاء بيئة واقية والحفاظ عليها. لقد أنشأنا إدخال الترميز الجيني PEDF ، وهو بروتين متعدد الوظائف يتم التعبي…
The authors have nothing to disclose.
وحظي هذا العمل بدعم البرنامج الإطاري السابع للاتحاد الأوروبي للبحث والتطوير التكنولوجي والبيان العملي، اتفاق المنحة رقم 305134. تم تمويل Zsuzsanna Izsvák من قبل مجلس البحوث الأوروبي ، ERC Advanced (ERC-2011-ADG 294742). يود المؤلفون أن يشكروا آنا دوبياس وأنتجي شيفر (قسم طب العيون ، مستشفى جامعة RWTH آخن) على الدعم الفني الممتاز ، وبنك آخن القرنية (قسم طب العيون ، مستشفى جامعة RWTH آخن) لتوفير عيون المتبرع البشري.
Isolation of primary human RPE cells | |||
24-Well Cell Culture Plate | Eppendorf, Hamburg, Germany | 0030722019 | |
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB) | Merck, Darmstadt, Germany | A2942 | |
Colibri Forceps | Geuder, Heidelberg, Germany | G-18950 | |
Curved Iris Forceps | Geuder, Heidelberg, Germany | G-18856 | |
Disposable Scalpel (No. 11) | Feather, Osaka, Japan | ||
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P04-41150 | |
Extra Fine Pointed Eye Scissor | Geuder, Heidelberg, Germany | G-19405 | |
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P40-37500 | |
Glass Pasteur Pipettes | Brand, Wertheim, Germany | 747715 | |
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep) | Merck, Darmstadt, Germany | P0781 | |
Pipette Tips (1000 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
Single Channel Pipette (100-1000 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Sterile Drape | Lohmann & Rauscher, Rengsdorf, Germany | ||
Sterile Gauze Compress | Fink-Walter, Merchweiler, Germany | 321063 | |
Sterile Gloves | Sempermed, Wien, Austria | ||
Sterile Petri Dish (Falcon 60 mm x 15 mm) | Corning, Corning, NY | 351007 | |
Sterile Surgical Gown | Halyard Health, Alpharetta, GA | ||
Straight Iris Forceps | Geuder, Heidelberg, Germany | G-18855 | |
Electroporation of primary human RPE cells | |||
10 mM Tris-HCl (pH 8.5) | |||
12-Well Cell Culture Plate | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 150628 | |
24-Well Cell Culture Plate | Eppendorf, Hamburg, Germany | 0030722019 | |
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB) | Merck, Darmstadt, Germany | A2942 | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P04-41150 | |
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P40-37500 | |
Inverted Microscope | Leica Mikrosysteme, Wetzlar, Germany | Leica DMi8 | |
Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | ||
Capillary Transfection System (Neon Transfection System) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | MPK5000 | |
Neon Transfection System 10 µL Kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | MPK1096 | |
Hemocytometer (Neubauer Chamber) | Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany | 0640110 | |
PBS Dulbecco w/o Ca2+ w/o Mg2+ | Biochrom, Berlin, Germany | L182-50 | |
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep) | Merck, Darmstadt, Germany | P0781 | |
Pipette Tips (10 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
Pipette Tips (1000 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
Pipette Tips (200 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
Plasmid Maxi Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 12163 | |
Single Channel Pipette (0.1-10 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Single Channel Pipette (100-1000 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Single Channel Pipette (10-200 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Trypan Blue Solution | Merck, Darmstadt, Germany | T8154 | |
Trypsin-EDTA (0,05 %) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 25300054 | |
Analyses of transfected primary human RPE cells | |||
10% SDS-Polyacrylamide Gel | |||
1x Incubation Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0) | |||
2x SDS Sample Buffer | |||
4x Incubation Buffer (200 mM NaH2PO4, 1.2 M NaCl, 40 mM imidazole, pH 8.0) | |||
Amersham Protran Supported 0.2 µm Nitrocellulose Blotting Membrane | Cytiva, Marlborough, MA | 10600015 | |
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB) | Merck, Darmstadt, Germany | A2942 | |
Anti-PEDF Antibodies (Rabbit Polyclonal) | BioProducts, Middletown, MD | AB-PEDF1 | |
Anti-Penta-His Antibodies (Mouse Monoclonal) | Qiagen, Hilden, Germany | 34660 | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P04-41150 | |
Elution Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8.0) | |||
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P40-37500 | |
Hemocytometer (Neubauer Chamber) | Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany | 0640110 | |
Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Mouse Antibodies (Rabbit Polyclonal) | Agilent Dako, Santa Clara, CA | P0260 | |
Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Rabbit Antibodies (Goat Polyclonal) | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab6721 | |
Human PEDF ELISA Kit | BioProducts, Middletown, MD | PED613 | |
LAS-3000 Imaging System | Fujifilm, Minato, Japan | ||
LightCycler 1.2 Instrument | Roche Life Science, Penzberg, Germany | ||
LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I | Roche Life Science, Penzberg, Germany | 12239264001 | |
LightCycler Capillaries (20 μl) | Roche Life Science, Penzberg, Germany | 4929292001 | |
Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | ||
Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Module | Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany | 1658015 | |
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel | Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany | 1658004 | |
Ni-NTA Superflow | Qiagen, Hilden, Germany | 30410 | |
PageRuler Prestained Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 26616 | |
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep) | Merck, Darmstadt, Germany | P0781 | |
Pipette Tips (10 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
Pipette Tips (1000 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
Pipette Tips (200 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany | 1645050 | |
QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 51304 | |
Reverse Transcription System | Promega, Madison, WI | A3500 | |
RNase-Free DNase Set | Qiagen, Hilden, Germany | 79254 | |
RNeasy Mini Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | |
Rocking Shaker | Cole-Parmer, Staffordshire, United Kingdom | SSM3 | |
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (2.0 mL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Single Channel Pipette (0.1-10 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Single Channel Pipette (100-1000 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Single Channel Pipette (10-200 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Trans-Blot Turbo Transfer System | Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany | 1704150 | |
Trypan Blue Solution | Merck, Darmstadt, Germany | T8154 | |
Trypsin-EDTA (0,05 %) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 25300054 |