Мы разработали протокол для трансфекции первичных пигментных эпителиальных клеток человека путем электропорации с геном, кодирующим фактор, полученный из пигментного эпителия (PEDF), с использованием транспозонной системы Sleeping Beauty (SB). Успешная трансфекция была продемонстрирована количественной полимеразной цепной реакцией (qPCR), иммуноблоттингом и иммуноферментным анализом (ИФА).
Наше все более стареющее общество приводит к росту заболеваемости нейродегенеративными заболеваниями. До сих пор патологические механизмы недостаточно изучены, что препятствует установлению определенных методов лечения. Клеточная аддитивная генная терапия для повышения экспрессии защитного фактора рассматривается как перспективный вариант лечения нейродегенеративных заболеваний, таких как возрастная макулярная дегенерация (ВМД). Мы разработали метод стабильной экспрессии гена, кодирующего пигментный эпителий-производный фактор (PEDF), который характеризуется как нейропротекторный и антиангиогенный белок в нервной системе, в геном первичных пигментных эпителиальных (PE) клеток человека с использованием транспозонной системы Sleeping Beauty (SB). Первичные ПЭ-клетки были выделены из глаз донора человека и сохранены в культуре. После достижения слияния 1 х 104 клетки суспендировали в 11 мкл буфера ресуспензии и соединяли с 2 мкл очищенного раствора, содержащего 30 нг гиперактивной плазмиды транспозазы SB (SB100X) и 470 нг транспозонной плазмиды PEDF . Генетическую модификацию проводили с помощью капиллярной электропорационной системы с использованием следующих параметров: два импульса напряжением 1 100 В и шириной 20 мс. Трансфектированные клетки переносили в культуральные пластины, содержащие среду, дополненную фетальной бычьей сывороткой; антибиотики и антимикотики добавляли с первым средним обменом. Успешная трансфекция была продемонстрирована в самостоятельно проведенных экспериментах. Количественная полимеразная цепная реакция (qPCR) показала повышенную экспрессию трансгена PEDF . Секреция PEDF была значительно повышена и оставалась стабильной, что оценивалось иммуноблоттингом и количественно оценивалось с помощью иммуноферментного анализа (ИФА). SB100X-опосредованный перенос позволил обеспечить стабильную интеграцию гена PEDF в геном клеток PE и обеспечил непрерывную секрецию PEDF, что имеет решающее значение для разработки клеточной генной аддитивной терапии для лечения ВМД или других дегенеративных заболеваний сетчатки. Более того, анализ профиля интеграции транспозона PEDF в клетки PE человека показал почти случайное геномное распределение.
Пожилой возраст описывается как основной риск нейродегенеративных заболеваний. Возрастная макулярная дегенерация (ВМД), полигенное заболевание, приводящее к тяжелой потере зрения у пациентов старше 60 лет, относится к четырем наиболее распространенным причинам слепоты и нарушения зрения1 и, как ожидается, увеличится до 288 миллионов человек в 2040году 2. Дисфункции пигментного эпителия сетчатки (RPE), одного слоя плотно упакованных клеток, расположенных между хориокапиллярами и фоторецепторами сетчатки, способствуют патогенезу ВМД. RPE выполняет множество задач, которые необходимы для нормальной функции сетчатки3 , и выделяет различные факторы роста и факторы, необходимые для поддержания структурной целостности сетчатки и хориокапилляра, тем самым поддерживая выживание фоторецепторов и обеспечивая основу для циркуляции и снабжения питательными веществами.
В здоровых глазах фактор, полученный из пигментного эпителия (PEDF), отвечает за балансировку эффектов фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и защищает нейроны от апоптоза, предотвращает пролиферацию эндотелиальных клеток и стабилизирует капиллярный эндотелий. Смещенное отношение VEGF к PEDF связано с глазной неоваскуляризацией, которая наблюдалась на животных моделях 4,5, а также в образцах пациентов с хориоидальной неоваскуляризацией (CNV) из-за ВМД и пролиферативной диабетической ретинопатии 6,7,8,9,10 . Повышенная концентрация VEGF является мишенью для текущего стандартного лечения. Анти-VEGF фармацевтические препараты бевацизумаб, ранибизумаб, афлиберцепт и, совсем недавно, бролуцизумаб улучшают остроту зрения примерно у одной трети пациентов с ХНВ или, скорее, стабилизируют зрение в 90% случаев 11,12,13. Однако частые, часто ежемесячные, интравитреальные инъекции несут риск нежелательных явлений14, ухудшают соблюдение пациентами и представляют собой значительную экономическую нагрузку для систем здравоохранения15. Более того, определенный процент пациентов (2%-20%) не реагируют или только плохо реагируют на анти-VEGF терапию 16,17,18,19. Эти негативные сопутствующие факторы требуют разработки альтернативных методов лечения, например, внутриглазных имплантатов, клеточных и/или генных терапевтических подходов.
Генная терапия эволюционировала как перспективное лечение наследственных и ненаследственных заболеваний и направлена на восстановление нефункциональных последовательностей генов или подавление неисправных. Для полигенных заболеваний, где выявление и замена причинных факторов вряд ли возможны, стратегии направлены на непрерывную доставку защитного фактора. В случае ВМД были разработаны различные аддитивные методы лечения, такие как стабильная экспрессия эндостатина и ангиостатина20, антагонист VEGF растворимый fms-подобная тирозинкиназа-1 (sFLT-1)21,22, регуляторный белковый кластер комплемента дифференцировки 59 (CD59)23 или PEDF24,25 . Глаз, и особенно сетчатка, является отличной мишенью для генного лекарства из-за закрытой структуры, хорошей доступности, небольшого размера и иммунной привилегии, что позволяет локализовать доставку низких терапевтических доз и делает трансплантацию менее восприимчивой к отторжению. Кроме того, глаз обеспечивает неинвазивный мониторинг, а сетчатка может быть исследована различными методами визуализации.
Вирусные векторы, благодаря своей высокой эффективности трансдукции, являются основным средством доставки терапевтических генов в клетки-мишени. Однако, в зависимости от используемого вирусного вектора, были описаны различные побочные реакции, такие как иммунные и воспалительные реакции26, мутагенные и онкогенные эффекты 27,28 или распространение в других тканях29. Практические ограничения включают ограниченный размер упаковки30, а также трудности и затраты, связанные с производством партий клинического сорта31,32. Эти недостатки способствовали дальнейшему развитию невирусных, основанных на плазмидах векторов, которые передаются через липо-/полиплексы, ультразвук или электропорацию. Однако геномная интеграция трансгена в геном хозяина обычно не стимулируется плазмидными векторами, что приводит к переходной экспрессии.
Транспозоны — это естественные фрагменты ДНК, которые изменяют свое положение в геноме, характеристика, которая была принята для генной терапии. Благодаря активному механизму интеграции векторные системы на основе транспозонов позволяют непрерывно и постоянно выражать вставленный трансген. Транспозон Спящей красавицы (SB), восстановленный из древнего транспозона типа Tc1/mariner, обнаруженного у рыб33 и дополнительно улучшенного молекулярной эволюцией, что привело к гиперактивному варианту SB100X34, обеспечил эффективную транспозицию в различных первичных клетках и использовался для фенотипической коррекции в различных моделях заболеваний35. В настоящее время начато 13 клинических испытаний с использованием транспозонной системы SB . Транспозонная система SB100X состоит из двух компонентов: транспозона, который содержит интересующий ген, окруженный терминальными инвертированными повторами (TR), и транспозазы, которая мобилизует транспозон. После доставки плазмидной ДНК в клетки транспозаза связывает TIF и катализирует иссечение и интеграцию транспозона в геном клетки.
Мы разработали невирусную клеточную аддитивную терапию для лечения неоваскулярной ВМД. Подход включает в себя электропорационную вставку гена PEDF в первичные пигментные эпителиальные (PE) клетки с помощью транспозонной системы SB100X 36,37,38. Генетическая информация транспозазы и PEDF предоставляется на отдельных плазмидах, что позволяет регулировать идеальное соотношение транспозонов SB100X к PEDF. Электропорация выполняется с использованием капиллярной трансфекционной системы на основе пипетки, которая характеризуется максимальным размером зазора между электродами при минимизации площади их поверхности. Было показано, что устройство достигает превосходных скоростей трансфекции в широком диапазоне клеток млекопитающих 39,40,41. Малая площадь поверхности электрода обеспечивает равномерное электрическое поле и уменьшает различные побочные эффекты электролиза42.
Антиангиогенная функциональность PEDF, секретируемая трансфектированными пигментными эпителиальными клетками, была показана в различных экспериментах in vitro, анализирующих прорастание, миграцию и апоптоз эндотелиальных клеток пуповинной вены человека43. Кроме того, трансплантация PEDF-трансфектированных клеток в кроличью модель неоваскуляризации роговицы44, а также крысиная модель CNV 43,45,46 показали снижение неоваскуляризации.
Здесь мы описываем подробный протокол для стабильной вставки гена PEDF в первичные клетки RPE человека через систему транспозонов SB100X с использованием системы капиллярной трансфекции. Трансфектированные клетки держали в культуре в течение 21 дня и впоследствии анализировали с точки зрения экспрессии гена PEDF с помощью количественной полимеразной цепной реакции (qPCR) и с точки зрения секреции белка PEDF путем иммуноблоттинга и иммуноферментного анализа (ИФА, рисунок 1).
В нашем проекте мы стремимся к невирусному производству генетически модифицированных первичных клеток RPE человека, которые постоянно сверхэкспрессируют и секретируют эффективный фактор, чтобы использовать трансфектированные клетки в качестве долгосрочного терапевтического средст…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Седьмой рамочной программой Европейского союза по исследованиям, технологическим разработкам и демонстрации, грантовым соглашением No 305134. Zsuzsanna Izsvák финансировалась Европейским исследовательским советом ERC Advanced (ERC-2011-ADG 294742). Авторы хотели бы поблагодарить Анну Добиас и Антье Шифер (отделение офтальмологии, университетская клиника RWTH Aachen) за отличную техническую поддержку, а также Aachen Cornea Bank (отделение офтальмологии, университетская клиника RWTH Aachen) за предоставление человеческим донорским глазам.
Isolation of primary human RPE cells | |||
24-Well Cell Culture Plate | Eppendorf, Hamburg, Germany | 0030722019 | |
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB) | Merck, Darmstadt, Germany | A2942 | |
Colibri Forceps | Geuder, Heidelberg, Germany | G-18950 | |
Curved Iris Forceps | Geuder, Heidelberg, Germany | G-18856 | |
Disposable Scalpel (No. 11) | Feather, Osaka, Japan | ||
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P04-41150 | |
Extra Fine Pointed Eye Scissor | Geuder, Heidelberg, Germany | G-19405 | |
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P40-37500 | |
Glass Pasteur Pipettes | Brand, Wertheim, Germany | 747715 | |
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep) | Merck, Darmstadt, Germany | P0781 | |
Pipette Tips (1000 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
Single Channel Pipette (100-1000 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Sterile Drape | Lohmann & Rauscher, Rengsdorf, Germany | ||
Sterile Gauze Compress | Fink-Walter, Merchweiler, Germany | 321063 | |
Sterile Gloves | Sempermed, Wien, Austria | ||
Sterile Petri Dish (Falcon 60 mm x 15 mm) | Corning, Corning, NY | 351007 | |
Sterile Surgical Gown | Halyard Health, Alpharetta, GA | ||
Straight Iris Forceps | Geuder, Heidelberg, Germany | G-18855 | |
Electroporation of primary human RPE cells | |||
10 mM Tris-HCl (pH 8.5) | |||
12-Well Cell Culture Plate | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 150628 | |
24-Well Cell Culture Plate | Eppendorf, Hamburg, Germany | 0030722019 | |
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB) | Merck, Darmstadt, Germany | A2942 | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P04-41150 | |
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P40-37500 | |
Inverted Microscope | Leica Mikrosysteme, Wetzlar, Germany | Leica DMi8 | |
Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | ||
Capillary Transfection System (Neon Transfection System) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | MPK5000 | |
Neon Transfection System 10 µL Kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | MPK1096 | |
Hemocytometer (Neubauer Chamber) | Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany | 0640110 | |
PBS Dulbecco w/o Ca2+ w/o Mg2+ | Biochrom, Berlin, Germany | L182-50 | |
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep) | Merck, Darmstadt, Germany | P0781 | |
Pipette Tips (10 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
Pipette Tips (1000 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
Pipette Tips (200 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
Plasmid Maxi Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 12163 | |
Single Channel Pipette (0.1-10 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Single Channel Pipette (100-1000 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Single Channel Pipette (10-200 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Trypan Blue Solution | Merck, Darmstadt, Germany | T8154 | |
Trypsin-EDTA (0,05 %) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 25300054 | |
Analyses of transfected primary human RPE cells | |||
10% SDS-Polyacrylamide Gel | |||
1x Incubation Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0) | |||
2x SDS Sample Buffer | |||
4x Incubation Buffer (200 mM NaH2PO4, 1.2 M NaCl, 40 mM imidazole, pH 8.0) | |||
Amersham Protran Supported 0.2 µm Nitrocellulose Blotting Membrane | Cytiva, Marlborough, MA | 10600015 | |
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB) | Merck, Darmstadt, Germany | A2942 | |
Anti-PEDF Antibodies (Rabbit Polyclonal) | BioProducts, Middletown, MD | AB-PEDF1 | |
Anti-Penta-His Antibodies (Mouse Monoclonal) | Qiagen, Hilden, Germany | 34660 | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P04-41150 | |
Elution Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8.0) | |||
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P40-37500 | |
Hemocytometer (Neubauer Chamber) | Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany | 0640110 | |
Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Mouse Antibodies (Rabbit Polyclonal) | Agilent Dako, Santa Clara, CA | P0260 | |
Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Rabbit Antibodies (Goat Polyclonal) | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab6721 | |
Human PEDF ELISA Kit | BioProducts, Middletown, MD | PED613 | |
LAS-3000 Imaging System | Fujifilm, Minato, Japan | ||
LightCycler 1.2 Instrument | Roche Life Science, Penzberg, Germany | ||
LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I | Roche Life Science, Penzberg, Germany | 12239264001 | |
LightCycler Capillaries (20 μl) | Roche Life Science, Penzberg, Germany | 4929292001 | |
Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | ||
Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Module | Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany | 1658015 | |
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel | Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany | 1658004 | |
Ni-NTA Superflow | Qiagen, Hilden, Germany | 30410 | |
PageRuler Prestained Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 26616 | |
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep) | Merck, Darmstadt, Germany | P0781 | |
Pipette Tips (10 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
Pipette Tips (1000 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
Pipette Tips (200 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany | 1645050 | |
QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 51304 | |
Reverse Transcription System | Promega, Madison, WI | A3500 | |
RNase-Free DNase Set | Qiagen, Hilden, Germany | 79254 | |
RNeasy Mini Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | |
Rocking Shaker | Cole-Parmer, Staffordshire, United Kingdom | SSM3 | |
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (2.0 mL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Single Channel Pipette (0.1-10 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Single Channel Pipette (100-1000 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Single Channel Pipette (10-200 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Trans-Blot Turbo Transfer System | Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany | 1704150 | |
Trypan Blue Solution | Merck, Darmstadt, Germany | T8154 | |
Trypsin-EDTA (0,05 %) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 25300054 |