Este protocolo proporciona un método para estudiar la infección por Mycobacterium tuberculosis en macrófagos polarizados M1 o M2 humanos basados en la diferenciación de monocitos de sangre periférica a células similares al macrófago que están infectadas con la cepa virulenta H37Rv etiquetada por GFP, y analizada con citometría de flujo utilizando un panel de 10 colores que incluye la expresión de marcadores M1/M2 seleccionados.
Los macrófagos humanos son células huésped primarias de la infección intracelular de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) y, por lo tanto, tienen un papel central en el control inmunológico de la tuberculosis (TB). Hemos establecido un protocolo experimental para seguir la polarización inmune de las células derivadas del mieloide en células similares al macrófago M1 (activadas clásicamente) o M2 (alternativamente activadas) a través de la evaluación con un panel de citometría de flujo de 10 colores que permite visualizar y caracterizar profundamente la Mtb etiquetada con proteína verde fluorescente (GFP) en diversos subconjuntos de macrófagos. Los monocitos obtenidos de donantes sanguíneos sanos se polarizaron en células M1 o M2 utilizando la diferenciación con el factor estimulador de colonias de macrófago de granulocito (GM-CSF) o factor estimulante de colonias de macrófago (M-CSF) seguido de polarización con IFN-γ y lipopolisacárido (LPS) o IL-4, respectivamente. Las células M1 y M2 totalmente polarizadas fueron infectadas con Mtb-GFP durante 4 horas antes de que los macrófagos separados infectados por Mtb se mancharan con citometría de flujo a las 4 o 24 horas posteriores a la infección. La adquisición de muestras se realizó con citometría de flujo y los datos se analizaron mediante un software de análisis de citometría de flujo. Se realizó un cálculo manual, así como una reducción de la dimensionalidad con aproximación y proyección uniforme del colector (UMAP) y análisis de fenógrafos. Este protocolo dio lugar a una polarización efectiva M1/M2 caracterizada por niveles elevados de células CD64, CD86, TLR2, HLA-DR y CCR7 en células M1 no infectadas, mientras que las células M2 no infectadas mostraron una fuerte regulación de los marcadores de fenotipo M2 CD163, CD200R, CD206 y CD80. Las células polarizadas M1 normalmente contenían menos bacterias en comparación con las células polarizadas por M2. Varios marcadores M1/M2 fueron regulados después de la infección por Mtb, lo que sugiere que Mtb puede modular la polarización del macrófago. Además, se encontraron 24 grupos celulares diferentes de diferentes tamaños que se distribuyeron de forma única entre las células infectadas por M1 y M2 y Mtb a las 24 horas posteriores a la infección. Este protocolo de citometría de flujo M1/M2 podría utilizarse como columna vertebral en la investigación de Mtb-macrofáfago y adoptarse para necesidades especiales en diferentes áreas de investigación.
Los macrófagos son células inmunes que contribuyen significativamente a la regulación de la homeostasis tisular, inflamación y patologías de la enfermedad. Al ser un componente esencial de la inmunidad innata, el linaje monocito-macrófago de las células expresa fenotipos heterogéneos en respuesta a señales ambientales alteradas, que reflejan su plasticidad y adaptación a diferentes lugares anatómicos e inmunológicos1. Dependiendo de los factores de crecimiento, citoquinas y otros mediadores presentes en el microambiente, los macrófagos se han categorizado en dos grandes poblaciones reversibles, cada una con un papel diferente en el control bacteriano y el aclaramiento2:los macrófagos polarizados M1 proinflamatorios y activados clásicamente M1 y los macrófagos antiinflamatorios y alternativamente activados con M2 polarizados que fueron nombrados originalmente para imitar la nomenclaturacelular T helper (Th). Esta agrupación de macrófagos polarizados inmunes a menudo se considera simplista, ya que la activación y diferenciación del macrófago no es lineal, sino que se ilustra con mayor precisión como un continuo donde cada población tiene diferentes características y roles funcionales en el resultado del desarrollo y progresión de la enfermedad4,5,6,7. Sin embargo, hay numerosas ventajas experimentales con el modelo de macrófago M1/M2 que se puede utilizar en varios campos diferentes de la investigación.
Mycobacterium tuberculosis (Mtb) es el agente causal de la tuberculosis (TB) y se ha estimado que infecta a una persona cada segundo y se considera el agente infeccioso único más letal del mundo (Informe mundial sobre la tuberculosis 2019). Dado que las vías respiratorias son la vía principal de la infección por Mtb, los macrófagos alveolares son las células huésped preferidas para infectarse con Mtb y representan tanto las barreras primarias como el reservorio infeccioso de Mtb en los pulmones. La polarización del macrófago en respuesta a diferentes estímulos se ha estudiado ampliamente a lo largo de los años7 y en la mayor parte del trabajo publicado, La polarización M1 de cultivos de monocitos in vitro es inducida por factor estimulante de colonias de granulocito-macrófago (GM-CSF) junto con IFN-γ y LPS8,9,mientras que la polarización M2 es inducida con factor estimulante de colonia de macrófago (M-CSF) e IL-410,11. Los macrófagos M1 son potentes células efectoras que median las respuestas antimicrobianas contra patógenos intracelulares y tienen un papel esencial en la inmunidad antitumoral12. Los macrófagos M2, por otro lado, tienen una función antiinflamatoria, alta capacidad fagocítica y están involucrados principalmente en la cicatrización de heridas y reparación de tejidos, así como en las infecciones del parásito12. En consecuencia, los macrófagos M1 se consideran más eficaces en el control intracelular de Mtb en comparación con los macrófagos M213. Sin embargo, las bacterias Mtb también tienen el potencial de modular la polarización del macrófago para subvertir la inmunidad innata14,15,16,17.
Si bien es común generar macrófagos a partir de la diferenciación de monocitos obtenidos de sangre periférica18,también se podrían generar macrófagos a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSC)19 o de macrófagos derivados de médula ósea de ratones20,21. Estas son técnicas factibles para estudiar células macrofágenas primarias obtenidas de progenitores monocitos/macrófago que proliferan y diferenciarán en una población homogénea de células maduras similares al macrófago. Sin embargo, estos protocolos rara vez proporcionan un conocimiento más profundo sobre el fenotipo y la función de las células obtenidas ni explican la heterogeneidad natural observada entre los macrófagos obtenidos in vivo. Como Mtb es un patógeno humano estricto, también hay una ventaja para estudiar Mtb en sistemas de modelos humanizados. La citometría de flujo es una potente tecnología que ofrece la posibilidad de evaluar múltiples características fenotípicas y funcionales de células individuales en la suspensión22,algo que podría ser bastante desafiante con células adherentes como macrófagos que también se sabe que son autofluorescentes23,24. Además del desprendimiento químico de macrófagos firmemente adherentes, la infección por Mtb puede representar un factor de estrés significativo para las células que añade otro nivel de complejidad en los análisis citométricos de flujo de macrófagos infectados con Mtb.
En este protocolo experimental, hemos utilizado un modelo de infección por macrófago humano previamente establecido basado en la polarización inmune de las células primarias derivadas de periféricos y monocitos sanguíneos que están infectadas con la virulenta cepa Mtb de laboratorio H37Rv, y analizadas con citometría de flujo utilizando un panel de 10 colores que incluye la expresión de marcadores M1 y M2 seleccionados25. Este protocolo proporciona un método eficiente y reproducible para estudiar las respuestas a la infección por Mtb en macrófagos polarizados de monocitoS M1 o M2. Además, el uso de citometría de flujo en macrófagos infectados por Mtb adherentes nos permite estudiar una variedad de marcadores de superficie asociados con macrófagos M1 y M2 convencionales y su respuesta longitudinal a la infección por Mtb. Es importante destacar que este protocolo puede adoptarse fácilmente para la investigación de infecciones con otros patógenos, en estudios antitumorales o en estudios de enfermedades inflamatorias, para la detección de fármacos, etc. y también podría ser explotado para la evaluación de la polarización del macrófago M1/M2 en muestras clínicas humanas.
Este protocolo experimental describe la polarización efectiva de las células derivadas del mieloide en fenotipos M1 o M2, incluida la evaluación con un panel de citometría de flujo de 10 colores que permite visualizar y caracterizar profundamente los Mtb etiquetados con GFP en diversos subconjuntos de macrófagos. Aunque la tuberculosis es una enfermedad humana antigua, actualmente no existe un modelo estándar dorado para estudiar las interacciones Mtb-macrófago, y la citometría de flujo multicolor de macrófagos podría complicarse en comparación con los análisis de las respuestas a los linfocitos. Pocos protocolos disponibles para la diferenciación in vitro de monocitos humanos a macrófagos presentan un profundo conocimiento del tipo de macrófagos generados. Un protocolo básico para la polarización del macrófago y la evaluación citométrica del flujo de la activación del macrófago utilizando un panel sólido de marcadores probablemente puede facilitar dicha caracterización y ofrecer oportunidades para explorar características adicionales de las células polarizadas tratadas en diferentes condiciones. Esto incluye análisis de células cultivadas in vitro, así como análisis de células in vivo en muestras clínicas, es decir, suspensiones de PBMC y unicelulares de fluidos corporales (es decir, lavado broncoalveolar) o tejido homogeneizado. En consecuencia, la diferenciación y/o el estado de activación de monocitos y macrófagos obtenidos de los pacientes podrían estar relacionados con el resultado de la enfermedad. Se ha notificado una expansión de CD16+CD163+ monocitos en sangre periférica en pacientes con tuberculosis pulmonar30. También se detectó un aumento de la frecuencia de las células CD163+ en la piel inflamada de los pacientes con dermatitis atópica31. Del mismo modo, se ha demostrado que los macrófagos similares a los CD206+ M2 inhiben la proliferación y diferenciación de células en el microambiente del tejido adipocito32 y se enriquecen en muestras de médula ósea de pacientes con leucemia mieloide aguda (LMA)29. Se encontró que una proporción elevada de células CD64 (M1) a CD163 (M2) en sangre entera de pacientes con osteoartritis se asoció con la gravedad de la enfermedad33. Otro estudio utilizó CD86 (M1) y CD163 (M2) para demostrar que la alta expresión M1 en el tejido se correlacionaba con un peor resultado en un subgrupo de tumores cerebrales malignos34.
Hay varias ventajas significativas de este protocolo experimental de citometría de flujo M1/M2. Este modelo ofrece la oportunidad de estudiar las respuestas inmunes innatas a la infección por Mtb virulenta y se puede desarrollar para contener estudios de respuestas inmunes adaptativas mediante la adición de células T autólogas junto con macrófagos M1 o M2 en reacciones de linfocitos mixtos (MLR). El protocolo también es adecuado para la detección de fármacos y pruebas de diferentes compuestos inmunomoduladores y antimicrobianos. Aquí, hemos estudiado previamente los efectos de la vitamina D y el inhibidor de la deacetilasa de piedra histone fenilbutirato en células derivadas del mieloide después de la infección por Mtb25,35. La citometría de flujo M1/M2 también podría utilizarse para evaluar la activación del macrófago después de acondicionar con sobrenautas de cultivo celular o plasma del paciente. Si bien los estudios in vivo de coinfección de tuberculosis con VIH o helmintos o co-morbilidad tb-diabetes podrían ser difíciles, el modelo M1/M2 menos complejo puede facilitar estudios de co-morbilidades in vitro. Del mismo modo, el protocolo podría ser explotado para estudios de transmisión para examinar la infectividad Mtb de las células o para investigar la capacidad de presentación de fácticos y antígenos de células M1/M2 individuales. La citometría de flujo M1/M2 también es atractiva para su uso en estudios de biomarcadores y vacunas, para seguir el pronóstico de la enfermedad durante el tratamiento y para probar terapias dirigidas a células derivadas del mieloide. Es importante destacar que una serie de métodos diferentes podrían aplicarse en paralelo a la citometría de flujo para la evaluación simultánea de fenotipos de polarización de macrófagos y respuestas funcionales utilizando microscopía confocal(Figura 3D),PCR en tiempo real, mancha occidental, ensayos multiplex y ELISA de factores solubles en el sobrenadante de cultivo, así como la evaluación de la infectividad bacteriana intracelular y el crecimiento utilizando la expresión GFP (citometría de flujo y microscopía confocal) y unidades formadoras de colonias (CFU). La infección de células M1 o M2 con bacterias Mtb-GFP también permite ordenar las células no infectadas y infectadas por Mtb de la misma muestra para el análisis de secuenciación de ARN de una sola célula.
El protocolo descrito también tiene algunas limitaciones, incluidas las desventajas técnicas y científicas. El inconveniente que utiliza macrófagos derivados de monocitos de donantes de sangre humana es que la variabilidad del donante a menudo es alta y el hecho de que las células no están polarizadas en el entorno fisiológico de los tejidos humanos. La gran variabilidad en la eficacia de la polarización M1/M2 o la infectividad de Mtb entre donantes puede dar lugar a problemas con variaciones intra e interexperimentales, bajo poder estadístico y la necesidad de incluir a muchos donantes para obtener resultados fiables. Además, la adherencia plástica de los monocitos de los PBMCs da lugar a un número dependiente del donante de monocitos/pozo que eventualmente puede proporcionar un MOI arbitrario que podría afectar la polarización del macrófago y la viabilidad celular después de la infección por Mtb. Los pasos críticos en el protocolo implican un lavado adecuado para evitar que otros tipos de células contaminen los cultivos celulares que también podrían afectar a la polarización del macrófago. Mientras que un MOI demasiado bajo puede imitar la infección por tuberculosis latente, un MOI demasiado alto matará las células, destacando la importancia de usar un MOI apropiado. Además, podría ser difícil recuperar células firmemente adherentes tras el desprendimiento, lo que puede dar lugar a una representación sesgada de ciertos subconjuntos de macrófagos utilizados para los análisis de citometría de flujo. Un paso crucial en el análisis de la citometría de flujo implica el uso adecuado de la matriz de compensación de cuentas y controles negativos como células no manchadas o controles FMO (Fluorescencia Menos Uno) para garantizar una correcta gating manual.
Otra limitación consiste en la polarización de monocitos derivados de la sangre y no del entorno tisular local. El sello distintivo de la tuberculosis humana es la formación de granulomas en tejidos infectados por Mtb y, por lo tanto, la inmunopatología en la tuberculosis debe estudiarse preferentemente en el sitio del tejido local. Sin embargo, los monocitos se reclutan al pulmón a partir de sangre periférica tras la inflamación/infección, donde las células pueden diferenciarse en macrófagos en presencia de citoquinas inflamatorias como gm-CSF12. Es importante destacar que, en el entorno fisiológico del tejido in vivo, es probable que haya una gran heterogeneidad de polarización del macrófago incluyendo una mezcla y diferentes proporciones de diversas poblaciones de macrófagos similares a M1 y M2 que contribuyen al destino de la infección por tuberculosis36. Anteriormente hemos desarrollado un modelo de tejido pulmonar organotípico humano que permite estudios 3D de formación de granuloma mediado por macrófago en TB37. Podría ser interesante explotar el protocolo de polarización M1/M2 actual en combinación con el modelo de tejido pulmonar para seguir estudiando la formación de granuloma de tuberculosis, las funciones del efector y la relación M1/M2 en el tejido experimental.
Este protocolo de diagrama de flujo M1/M2 podría adaptarse fácilmente para incluir un panel extendido de marcadores mieloides útiles para la evaluación de características asociadas con respuestas inhibitorias e inflamatorias. Hay un gran interés de investigación en moléculas inhibitorias de punto de control inmune como PD-1, SIRP-α, IDO y arginases que podrían modular las respuestas de macrófago38. En este contexto, la polarización de las células mieloides también podría implicar otros estímulos que promuevan los macrófagos inmunoreguladores (Mreg) o las células supresoras derivadas del mieloide (MDSC) que se ha demostrado que están implicadas en varias enfermedades, incluida la tuberculosis38. Los paneles de citometría de flujo más avanzados de los subconjuntos de macrófagos M1/M2/Mreg también pueden incluir tinción intracelular de citoquinas/quimioquinas IL-1β, TNF-α, IL-10 y MCP-1 u otros factores solubles o moléculas efectores como óxido nítrico inducible (iNOS) y péptidos antimicrobianos. Esto podría mejorar las posibilidades de estudiar las respuestas de macrófago polifuncional, similar a lo que se ha descrito extensamente para las células T39.
Actualmente, los paneles de tinción de citometría de flujo pueden incluir hasta 30-40 colores, lo que proporciona la capacidad de inmunofenotipo de múltiples subconjuntos celulares y moléculas simultáneamente. La configuración experimental básica de este protocolo de citometría de flujo M1/M2 puede utilizarse como columna vertebral compatible con la mayoría de los cytómetros de flujo antiguos y nuevos y se puede construir y adaptar según las necesidades individuales, incluidos los desafíos planteados por el trabajo con Mtb virulenta en un entorno BSL-3. Hoy en día, técnicas de reducción de dimensionalidad como UMAP están disponibles en las nuevas versiones del software de citometría de flujo, lo que permite el análisis de un gran número de parámetros generados en estudios unicelulares que es esencial para mejorar la visualización e interpretación de datos en alta dimensión40. Las constantes mejoras tecnológicas en la citometría de flujo probablemente continuarán en los próximos años, incluyendo la combinación de fenotipado multiparamétrico junto con capacidades modernas de clasificación celular, donde este protocolo podría resultar útil en varios ensayos de infección por Mtb basados en macrófagos.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a nuestros colegas de la Agencia de Salud Pública de Suecia, Matilda Svensson y Solomon Ghebremichael por su asistencia en el laboratorio BSL-3.
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Sueca del Corazón y el Pulmón (HLF) (2019-0299 y 2019-0302 a SB), el Consejo Sueco de Investigación (VR) (2014-02592, 2019-01744 y 2019-04720 a SB), la Fundación para Prevenir la Resistencia a los Antibióticos (Resistencia), las Fundaciones Karolinska Institutet y KID a SB (financiación parcial de la educación doctoral para Marco Loreti) del Instituto Karolinska. Ml recibió el apoyo de la Fundación Sueca contra el Cáncer Infantil (TJ2018-0128 y PR2019-0100).
8-well chamber slides | Lab-Tek | 154534 | |
BD Comp bead plus | BD | 560497 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
DAPI Mounting media | Vector Laboratories | H-1200-10 | |
EDTA (0.5 M) | Karolinska University hospital, Huddinge | N/A | |
Falcon 6-well Flat Bottom plates | Corning Life Sciences | 353046 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
Glycerol (70%) | Karolinska University hospital, Huddinge | N/A | |
GM-CSF | Peprotech | 300-03 | |
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 594 secondary antibody | Invitrogen | R37121 | Secondary antibody for CD64 |
Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 594 secondary antibody | Invitrogen | A-11037 | Secondary antibody for CD163 |
HEPES | GE Healthcare Life Sciences | SH30237.01 | |
IFN-γ | Peprotech | 300-02 | |
IL-4 | Peprotech | 200-04 | |
L-Glutamine | GE Healthcare Life Sciences | SH30034.01 | |
LPS (Escherichia coli O55:B5) | Sigma-Aldrich | L6529 | |
Lymphoprep | Alere Technologies AS | 11508545 | |
M-CSF | Peprotech | 300-25 | |
Middle Brook 7H10 agar plates | Karolinska University hospital, Huddinge | N/A | |
Middle Brook 7H9 media | Karolinska University hospital, Huddinge | N/A | |
Mouse anti-human CD64 primary antibody | Bio-Rad | MCA756G | Clone: 10.1 |
Na-pyruvate | GE Healthcare Life Sciences | SH300239.01 | |
Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
Rabbit anti-human CD163 primary antibody | GeneTex | GTX81526 | Polyclonal |
RPMI 1640 | Life Technologies Corporation | SH30096.01 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X-100 | |
TubeSpin bioreactor tubes | TPP Techno Plastic Products AG | 87050 | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
Tween-80 | Sigma-Aldrich | P4780 |