본 프로토콜은 MFP 라벨이 부착된 악성 균주 H37Rv에 감염된 대식세포와 말초 혈액 단혈세포의 분화에 기초하여 인간 M1 또는 M2 편광 대식세포에서 진코박테리움 결핵 감염을 연구하고, M1의 마커를 포함한 10색 마커를 사용하여 유동 세포암법으로 분석하는 방법을 제공한다.
인간 대식세포는 세포내 진균 결핵(Mtb) 감염의 1차 숙주 세포이며 따라서 결핵의 면역 조절에 중심적인 역할을 합니다(TB). 우리는 다양한 대시파소에서 녹색 형광 단백질 (GFP)의 시각화 및 깊은 특성화를 허용하는 10 색 유동 세포 측정 패널을 사용하여 평가를 통해 골수성 유래 세포의 면역 편광을 M1 (고전적으로 활성화) 또는 M2 (대안적으로 활성화) 대식세포와 같은 세포로 추적하는 실험 프로토콜을 설립했습니다. 건강한 혈액 기증자로부터 얻은 단세포는 과립구 대식세포-콜로니 자극 인자(GM-CSF) 또는 대식세포 식민지 자극인자(M-CSF)를 이용한 분화를 이용하여 M1 또는 M2 세포로 편광되었고, IFN-γ 및 리포폴리사카라이드(LPS) 또는 IL-4를 이용한 편광이 뒤따랐다. 완전히 편광된 M1 및 M2 세포는 분리된 Mtb-감염 대식세포가 감염 후 4시간 또는 24시간 후 유동 세포형으로 염색되기 전에 4시간 동안 Mtb-GFP에 감염되었다. 샘플 수집은 유동 세포측정을 사용하여 수행되었고 데이터는 유동 세포 분석 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 수동 게이팅뿐만 아니라 균일 한 매니폴드 근사치 및 프로젝션 (UMAP) 및 표현판 분석을 사용하여 치수 감소가 수행되었다. 이 프로토콜은 감염되지 않은 M1 세포에 CD64, CD86, TLR2, HLA-DR 및 CCR7의 높은 수준을 특징으로 하는 효과적인 M1/M2 편광을 초래했으며, 감염되지 않은 M2 세포는 M2 표현형 마커 CD163, CD200R, CD206 및 CD8000의 강력한 업 레귤레이션을 나타냈다. M1 편광 세포는 전형적으로 M2 편광 세포에 비해 적은 박테리아를 포함했다. 몇몇 M1/M2 마커는 Mtb 감염 후에 다운규제되었습니다, 이는 Mtb가 대식세포 편광을 조절할 수 있다는 것을 건의합니다. 또한, 상이한 크기의 24개의 상이한 세포 클러스터는 24시간 감염 후 M1 및 M2 감염 및 Mtb 감염 세포 간에 유일하게 분포되는 것으로 나타났다. 이 M1/M2 유량 세포측정 프로토콜은 Mtb 대식세포 연구의 중추로 사용될 수 있으며 다양한 연구 분야에서 특별한 필요를 위해 채택될 수 있습니다.
대식세포는 조직 항상성, 염증 및 질병 병리학의 조절에 크게 기여하는 면역 세포입니다. 선천성 면역의 필수 성분인 세포의 단핵세포 계보는 다른 해부학 적 및 면역학적 위치에 대한 가소성과 적응을 반영하는 변경된 환경 단서에 대응하여 이질적인 표현형을표현한다. 마이크로 환경에 존재하는 성장 인자, 사이토카인 및 기타 중재자에 따라, 대식세포는 세균 조절 및 클리어런스에 다른 역할을 각각 두 개의 주요 가역 인구로 분류되었습니다2: 프로 염증, 고전적으로 활성화 된 M1 편광 대식세포 및 항 염증, 대안 적으로 활성화 된 M2 편광 거처는 원래 Tcler cell (Tcler cell)을 모방하기 위해 명명되었다. 이러한 면역 편광 대식세포의 그룹화는 대식세포 활성화 및 분화가 선형이 아니기 때문에 종종 단순하게 간주되지만, 각 집단이 질병 발달 및 진행의 결과에 각각의 특성과 기능적 역할을 가지는 연속체로 보다 정확하게 도시화된다4,5,6,7. 그럼에도 불구 하 고, 연구의 여러 다른 분야에서 사용할 수 있는 M1/M2 대식 세포 모델과 수많은 실험 적인 장점이 있다.
진균 결핵 (Mtb)은 결핵 (TB)의 원인 에이전트이며 매 초마다 한 사람을 감염시키는 것으로 추정되며 세계에서 가장 치명적인 단일 전염성 요원으로 간주됩니다 (글로벌 결핵 보고서 2019). 호흡기는 Mtb 감염의 주요 경로이기 때문에 폐포 대식세포는 Mtb에 감염되는 바람직한 숙주 세포이며 폐내 Mtb에 대한 1 차적인 장벽과 전염성 저수지를 모두 나타낸다. 다른 자극에 대응하여 대식세포 편광은7년 동안 광범위하게 연구되었으며 대부분의 출판된 저작물에서, 시험관 내 의 단핵구 배양의 M1 편광은 IFN-γ 및 LPS8,9와함께 과립구-대식체 식민지 자극계(GM-CSF)에 의해 유도되며, M2 편광은 대식세포 식민지 자극계(M-CSF) 및 IL-410,11로유도된다. M1 대식세포는 세포내 병원체에 대한 항균 반응을 중재하고 항종양면역(12)에필수적인 역할을 하는 강력한 이펙터 세포이다. M2 대식세포는, 한편으로, 항염증 기능, 높은 phagocytic 용량을 가지며 주로 상처 치유 및 조직 수리뿐만 아니라 기생충감염(12)에관여한다. 이에 따라, M1 대식세포는 M2대식세포(13)에비해 Mtb의 세포내 대조군에서 보다 효과적인 것으로 여겨진다. 그러나, Mtb 박테리아는 또한 선천성 면역14,15,16,17을전복하기 위하여 대식세포 편광을 조절할 가능성이있다.
말초혈액(18)으로부터얻은 단핵구의 분화로부터 대식세포를 생성하는 것이 일반적이지만, 대식세포는 유도된 다능성 줄기세포(iPSC)19 또는 마우스로부터 골수 유래 대식세포로부터 생성될 수있다( 20,21). 이들은 성숙한 대식세포 같이 세포의 균질한 인구로 증식하고 분화할 단색 세포/대식세포 선조에서 얻은 1차 대식세포 세포를 연구하는 것이 가능한 기술입니다. 그러나, 이들 프로토콜은 생체내에서 수득된 대식세포 사이에서 관찰된 자연 이질성을 고려하여 얻어진 세포의 표현형 및 기능에 대한 심화된 지식을 거의 제공하지 않는다. Mtb는 엄격한 인간 병원체이기 때문에 인간화 모델 시스템에서 Mtb를 연구할 수 있는 이점도 있습니다. 유동 세포측정은서스펜션(22)에서단일 세포의 다중 현상 및 기능적 특성을 평가할 수 있는 가능성을 제공하는 강력한 기술로, 또한 자가형23,24로알려진 대식세포와 같은 부착세포로 상당히 도전적일 수 있다. 단단히 부착 된 대식세포의 화학 적 분리 외에도 Mtb 감염은 Mtb 감염된 대식세포의 유동 세포 측정 분석에서 또 다른 수준의 복잡성을 추가하는 세포에 중요한 스트레스 인자를 제기 할 수 있습니다.
본 실험 프로토콜에서, 우리는 악성 실험실 Mtb 균주 H37Rv에 감염된 1 차말말피 단화 유래 세포의 면역 편광에 기초하여 이전에 확립 된 인간 대식세포 감염 모델을 사용하고, 선택된 M1 및 M2 마커25의발현을 포함하는 10 색 패널을 사용하여 유동 세포측정으로 분석하였다. 이 프로토콜은 M1 또는 M2 편광 단핵구 유래 대식세포에서 Mtb 감염에 대한 반응을 연구하는 효율적이고 재현 가능한 방법을 제공합니다. 또한, 부착된 Mtb-감염된 대식세포에 유동 세포형의 사용은 우리가 기존의 M1 및 M2 대식세포와 관련된 다양한 표면 마커와 Mtb 감염에 대한 그들의 세로 반응들을 연구할 수 있게 한다. 중요한 것은, 이 프로토콜은 다른 병원체와의 감염, 항종양 연구 또는 염증 조건의 연구, 약물 스크리닝 등에 대한 감염의 조사를 위해 쉽게 채택될 수 있으며, 인간 임상 샘플에서 M1/M2 대식세포 편광의 평가를 위해 악용될 수도 있다.
이 실험 프로토콜은 다양한 대식세포 하위 세트에서 GFP 라벨 Mtb의 시각화 및 깊은 특성화를 허용하는 10색 유동 세포측정 패널을 사용하여 평가를 포함하여 골수이드 유래 세포의 효과적인 편광을 M1 또는 M2 표현형으로 효과적으로 편광하는 것을 설명합니다. 결핵은 고대 인간 질병이지만, 현재 Mtb 대식세포 상호 작용을 연구하는 황금 표준 모델은 없으며, 대식세포의 다색 유동 세포측정은 림프구 반응의 분석에 비해 복잡할 수 있습니다. 대식세포에 인간 단핵구의 체외 분화를 위한 사용 가능한 프로토콜은 거의 생성된 대식세포의 모형에 대한 깊은 지식을 제시합니다. 마커의 고체 패널을 사용하여 대식 세포 활성화의 대식 세포 극화 및 유량 세포 측정 평가를위한 기본 프로토콜은 가능성이 이러한 특성화를 용이하게하고 다른 조건에서 처리 편광 세포의 추가 기능을 탐구 할 수있는 기회를 제공 할 수 있습니다. 여기에는 체외에서 배양된 세포의 분석뿐만 아니라 임상 샘플에서 생체 내 세포의 분석, 즉 체액(즉, 기관지 알릴라 라베이지) 또는 균질화 조직으로부터 의 PBMC 및 단일 세포 현탁액을 모두 포함한다. 따라서 환자에게서 얻은 단핵구 및 대식세포의 분화 및/또는 활성화 상태는 질병 결과와 관련이 있을 수 있다. 폐 결핵환자(30)에서말초 혈액에서 CD16+CD163+ 단핵구의 팽창이 보고되었다. CD163+ 세포의 증가된 주파수도 아토피성 피부염 환자의 염증피부에서검출되었다(31). 유사하게, CD206+ M2유사 대식세포는 지방분혈구조직(32)의 미세 환경에서 세포의 증식 및 분화를 억제하고 급성 골수성 백혈병(AML) (AML)29환자로부터골수 샘플에서 농축되는 것으로 나타났다. 골관절염 환자의 전혈에서 CD64(M1)에서 CD163(M2) 세포의 높은 비율은 질병심각도(33)와연관된 것으로 나타났다. 또 다른 연구는 CD86 (M1) 및 CD163 (M2)를 사용하여 조직의 높은 M1 발현이 악성 뇌종양34의하위 그룹에서 악화 된 결과와 상관관계가 있음을 입증하였다.
이 실험적인 M1/M2 유량 세포측정 프로토콜에는 몇 가지 중요한 장점이 있습니다. 이 모델은 악성 Mtb 감염에 대한 타고난 면역 반응을 연구할 수 있는 기회를 제공하며 혼합 림프구 반응(MlRs)에서 M1 또는 M2 대식세포와 함께 자가 T 세포를 추가하여 적응성 면역 반응의 연구를 포함하도록 개발될 수 있다. 이 프로토콜은 또한 다른 면역 조절 및 항균 화합물의 약물 선별 및 테스트에도 적합합니다. 여기서, 우리는 이전에 Mtb 감염 후 골수성 유래 세포에 비타민 D와 히스톤 deacetylase 억제제 페닐부티레이트(25,35)의효과를 연구했다. M1/M2 유량 세포측정은 세포 배양 체상제 또는 환자 혈장과 컨디셔닝 한 후 대식 세포 활성화를 평가하는 데 사용될 수 있습니다. HIV 또는 기생충 또는 결핵 당뇨병 공동 이환율을 가진 결핵 공동 감염의 생체 내 연구에서는 어려울 수 있지만, 덜 복잡한 M1/M2 모델은 체외에서 공동 이환율의 연구를 용이하게 할 수 있습니다. 마찬가지로, 프로토콜은 세포의 Mtb 감염성을 검사하거나 개별 M1/M2 세포의 항원 프리젠 테이션 능력뿐만 아니라 phagocytic을 조사하기 위해 전송 연구를 위해 악용 될 수있다. M1/M2 유동 세포측정은 바이오마커 및 백신 연구에서 사용, 치료 중 질병 예후를 따르고 골수성 유래 세포를 대상으로 하는 치료법을 테스트하는 데도 매력적입니다. 중요하게도, 공초점현미경(도 3D),실시간 PCR, 대식세포 편광 표현형 및 기능반응의 동시 평가를 위해 다양한 다른 방법이 동조세포측정을 동시에 평가할 수 있다. 서양 블롯, 멀티플렉스 분석및 배양 상류체에 있는 수용성 인자의 ELISA뿐만 아니라 GFP 발현(유동 세포측정 및 공초점 현미경 검사법) 및 식민지 형성 단위(CFU)를 이용한 세포내 세균 감염 및 성장의 평가. Mtb-GFP 박테리아를 가진 M1 또는 M2 세포의 감염은 또한 단하나 세포 RNA 염기분석 분석을 위한 동일 견본에서 감염되지 않은 및 Mtb 감염한 세포를 분류하는 가능하게 합니다.
설명된 프로토콜에는 기술적 및 과학적 단점을 포함한 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 인간의 혈액 기증자로부터 단핵구 유래 대식세포를 이용한 단점은 기증자가 종종 가변성이 높고 세포가 인간 조직의 생리환경에서 편광되지 않는다는 사실이다. 기증자 들 간의 M1/M2 편광 효능 또는 Mtb 감염성의 큰 가변성은 내- 및 상호 실험적 변이, 낮은 통계적 전력 및 신뢰할 수 있는 결과를 얻기 위해 많은 기증자를 포함하는 필요 모두에 문제가 발생할 수 있습니다. 또한, PBMC로부터 단핵구의 플라스틱 준수는 기증자 의존성 모노사이클/웰의 결과로, 결국 Mtb 감염 후 대식세포 편광 및 세포 생존가능성에 영향을 미칠 수 있는 임의의 MOI를 제공할 수 있다. 프로토콜의 중요한 단계는 또한 대식세포 편광에 영향을 미칠 수 있는 세포 배양을 오염시키기 위하여 그밖 세포 모형을 방지하기 위하여 적당한 세척을 관련시킵니다. 너무 낮은 MOI는 잠복 결핵 감염을 모방할 수 있지만, 너무 높은 MOI는 세포를 죽이고 적절한 MOI를 사용하는 것의 중요성을 강조합니다. 더욱이, 분리 시 단단히 부착된 세포를 회수하기 어려울 수 있으며, 이는 유동 세포 분석에 사용되는 특정 대식세포 서브세트의 편향된 표현을 초래할 수 있다. 유동 세포 측정 분석의 중요한 단계는 올바른 수동 게이팅을 보장하기 위해 비스타 보상 매트릭스와 스테인드 셀 또는 FMO (형광 마이너스 원) 제어와 같은 부정적인 컨트롤을 적절히 사용하는 것입니다.
또 다른 제한은 혈액에서 파생된 단핵구의 편광이 아니라 국소 조직 환경에서 분리하는 것을 포함합니다. 인간 결핵의 특징은 Mtb 감염 조직에 있는 육아종의 대형이고 이렇게, 결핵에 있는 면역병리학은 현지 조직 사이트에서 우선적으로 공부되어야 합니다. 그러나, 단핵구는 염증/감염시 말초 혈액으로부터 폐로 모집되며, 여기서 세포는 GM-CSF12와같은 염증성 사이토카인이 있는 경우 대식세포로 분화할 수 있다. 중요한 것은, 생체 내 조직의 생리적 밀리우에서, 결핵 감염의 운명에 기여하는 다양한 M1-및 M2와 같은 대식세포 집단의 혼합물 및 상이한 비율을 포함하는 대식세포 편광의 큰 이질성이 있을 가능성이 있다36. 우리는 이전에 TB 37에서 대식세포 매개 육아종 형성의 3D 연구를 가능하게 하는 인간 organotypic 폐 조직 모형을개발했습니다. 현재 M1/M2 편광 프로토콜을 폐 조직 모델과 결합하여 결핵 과립종 형성, 이펙터 기능 및 M1/M2 비율을 실험 조직에서 추가로 연구하는 것은 흥미로울 수 있다.
이 M1/M2 유량성 프로토콜은 염증 반응뿐만 아니라 억제와 관련된 특징의 평가에 유용한 골수성 마커의 확장 패널을 포함하도록 쉽게 적응될 수 있었다. 대식세포 반응38을조절할 수 있는 PD-1, SIRP-α, IDO 및 아르지나제와 같은 억제 면역 체크포인트 분자에 대한 훌륭한 연구 관심이 있다. 이러한 맥락에서, 골수성 세포의 편광은 또한 TB38을포함한 여러 질병에 관여하는 것으로 나타난 면역 조절 대식세포(Mreg) 또는 골로이드 유래 억제제 세포(MDSC)를 촉진하는 다른 자극을 포함할 수 있다. M1/M2/Mreg 대식세포 서브세트의 고급 유동 세포측정패널에는 세포사내 염색/케모킨 IL-1β, TNF-α, IL-10 및 MCP-1 또는 유도성 산화질소(iNOS) 및 항균성 과 같은 기타 수용성 인자 또는 이펙터 분자를 포함할 수 있다. 이것은 T 세포(39)에대해 광범위하게 설명된 것과 유사한 다기능 대식세포 반응을 연구할 가능성을 향상시킬 수 있다.
현재, 유동 세포역학 염색 패널은 최대 30-40색을 포함할 수 있으며, 이는 면역페노타입 다중 세포 서브세트 및 분자를 동시에 면역할 수 있는 능력을 제공한다. 이 M1/M2 유량 세포측정 프로토콜의 기본 실험 설정은 대부분의 기존 및 새로운 유동 세포계와 호환되는 백본으로 사용할 수 있으며 BSL-3 환경에서 악성 Mtb로 작업하여 야기되는 과제를 포함하여 개별 요구에 따라 구축및 맞춤화될 수 있습니다. 요즘UMAP과 같은 치수 감소 기술은 새로운 버전의 유동 세포측정 소프트웨어에서 사용할 수 있으며, 이는 고차원데이터(40)의시각화 및 해석을 개선하는 데 필수적인 단일 세포 연구에서 생성된 많은 수의 파라미터를 분석할 수 있게 한다. 흐름 세포측정에 있는 일정한 기술 적인 개선은 이 프로토콜이 몇몇 대식세포 기지를 둔 Mtb 감염 분석에서 유용하다는 것을 증명할 수 있던 현대 세포 분류 기능과 함께 다중 파라메트릭 phenotyping의 조합을 포함하여 앞으로 도래할 것입니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 스웨덴의 공중 보건 국, 마틸다 스벤슨과 솔로몬 게브레마이클BSL-3 실험실에서 도움을 준 동료들에게 감사드립니다.
이 작품은 스웨덴 심장 및 폐 재단 (HLF)(2019-0299 및 2019-0302)에서 SB, 스웨덴 연구 위원회 (VR) (2014-02592)의 보조금에 의해 지원되었습니다. 2019-01744 및 2019-04720 SB), 항생제 저항 방지 재단 (저항), 카롤린스카 연구소 재단 및 KID SB (마르코 로레티 박사 교육의 부분 자금 조달) 카롤린스카 연구소에서. ML은 스웨덴 아동 암 재단 (TJ2018-0128 및 PR2019-0100)에서 지원되었습니다.
8-well chamber slides | Lab-Tek | 154534 | |
BD Comp bead plus | BD | 560497 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
DAPI Mounting media | Vector Laboratories | H-1200-10 | |
EDTA (0.5 M) | Karolinska University hospital, Huddinge | N/A | |
Falcon 6-well Flat Bottom plates | Corning Life Sciences | 353046 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
Glycerol (70%) | Karolinska University hospital, Huddinge | N/A | |
GM-CSF | Peprotech | 300-03 | |
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 594 secondary antibody | Invitrogen | R37121 | Secondary antibody for CD64 |
Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 594 secondary antibody | Invitrogen | A-11037 | Secondary antibody for CD163 |
HEPES | GE Healthcare Life Sciences | SH30237.01 | |
IFN-γ | Peprotech | 300-02 | |
IL-4 | Peprotech | 200-04 | |
L-Glutamine | GE Healthcare Life Sciences | SH30034.01 | |
LPS (Escherichia coli O55:B5) | Sigma-Aldrich | L6529 | |
Lymphoprep | Alere Technologies AS | 11508545 | |
M-CSF | Peprotech | 300-25 | |
Middle Brook 7H10 agar plates | Karolinska University hospital, Huddinge | N/A | |
Middle Brook 7H9 media | Karolinska University hospital, Huddinge | N/A | |
Mouse anti-human CD64 primary antibody | Bio-Rad | MCA756G | Clone: 10.1 |
Na-pyruvate | GE Healthcare Life Sciences | SH300239.01 | |
Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
Rabbit anti-human CD163 primary antibody | GeneTex | GTX81526 | Polyclonal |
RPMI 1640 | Life Technologies Corporation | SH30096.01 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X-100 | |
TubeSpin bioreactor tubes | TPP Techno Plastic Products AG | 87050 | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
Tween-80 | Sigma-Aldrich | P4780 |