Dieses Protokoll bietet eine Methode zur Untersuchung der Mycobacterium tuberculosis-Infektion bei menschlichen M1- oder M2-polarisierten Makrophagen auf der Grundlage der Differenzierung von peripheren Blutmonozyten zu Makrophagen-ähnlichen Zellen, die mit dem GFP-markierten virulenten Stamm H37Rv infiziert und mit Durchflusszytometrie mit einem 10-Farben-Panel einschließlich der Expression ausgewählter M1/M2-Marker analysiert werden.
Humane Makrophagen sind primäre Wirtszellen der intrazellulären Mycobacterium tuberculosis (Mtb)-Infektion und spielen somit eine zentrale Rolle bei der Immunkontrolle von Tuberkulose (TB). Wir haben ein experimentelles Protokoll entwickelt, um die immunpolarisation von myeloiden Zellen in M1 (klassisch aktiviert) oder M2 (alternativ aktivierte) Makrophagen-ähnliche Zellen durch Bewertung mit einem 10-farbenigen Durchflusszytometrie-Panel zu verfolgen, das die Visualisierung und Tiefencharakterisierung von grünfluoreszierendem Protein (GFP)-markierten Mtb in verschiedenen Makropages-Untersätzen ermöglicht. Monozyten, die von gesunden Blutspendern gewonnen wurden, wurden in M1- oder M2-Zellen polarisiert, wobei die Differenzierung mit Granulozytenmakrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor (GM-CSF) oder Makrophagenkolonien-stimulierendem Faktor (M-CSF) gefolgt von einer Polarisation mit IFN-γ und Lipopolysaccharid (LPS) bzw. IL-4 erfolgte. Voll polarisierte M1- und M2-Zellen wurden 4 Stunden lang mit Mtb-GFP infiziert, bevor freigelöste Mtb-infizierte Makrophagen nach einer 4- oder 24-stündigen Nachinfektion mit Durchflusszytometrie befleckt wurden. Die Probenerfassung wurde mit Durchflusszytometrie durchgeführt und die Daten mit einer Flow-Zytometrie-Analysesoftware analysiert. Manuelles Gating sowie Dimensionalitätsreduktion mit Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) und Phenograph analyse wurde durchgeführt. Dieses Protokoll führte zu einer effektiven M1/M2-Polarisation, die sich durch erhöhte Konzentrationen von CD64, CD86, TLR2, HLA-DR und CCR7 auf nicht infizierten M1-Zellen auszeichnete, während nicht infizierte M2-Zellen eine starke Upregulation der M2-Phänotypmarker CD163, CD200R, CD206 und CD80 aufwiesen. M1-polarisierte Zellen enthielten in der Regel weniger Bakterien als M2-polarisierte Zellen. Mehrere M1/M2-Marker wurden nach einer Mtb-Infektion herunterreguliert, was darauf hindeutet, dass Mtb die Makrophagenpolarisation modulieren kann. Darüber hinaus wurden 24 verschiedene Zellcluster unterschiedlicher Größe bei 24-Stunden-Nachinfektions-Zellen auf einzigartige Weise auf die nicht infizierten und Mtb-infizierten Zellen M1 und M2 verteilt. Dieses M1/M2-Flow-Zytometrie-Protokoll könnte als Rückgrat in der Mtb-Makrophagenforschung verwendet und für besondere Bedürfnisse in verschiedenen Forschungsbereichen eingesetzt werden.
Makrophagen sind Immunzellen, die wesentlich zur Regulierung von Gewebehomöostase, Entzündungen und Krankheitspathologien beitragen. Als wesentlicher Bestandteil der angeborenen Immunität drückt die Monozyten-Makrophagen-Linie der Zellen heterogene Phänotypen als Reaktion auf veränderte Umwelthinweise aus, die ihre Plastizität und Anpassung an verschiedene anatomische und immunologische Standorte widerspiegeln1. Abhängig von den Wachstumsfaktoren, Zytokinen und anderen Indenzionen, die in der Mikroumgebung vorhanden sind, wurden Makrophagen in zwei hauptumkehrbare Populationen eingeteilt, die jeweils eine andere Rolle bei der bakteriellen Kontrolle und Clearance2haben: die pro-inflammatorischen, klassisch aktivierten M1-polarisierten Makrophagen und die entzündungshemmenden, alternativ aktivierten M2-polarisierten Makrophagen, die ursprünglich als Imitierungs-T-Helfer (Th) bezeichnetwurden. Diese Gruppierung von immunpolarisierten Makrophagen wird oft als vereinfachend angesehen, da Makrophagenaktivierung und -differenzierung nicht linear ist, sondern genauer als Kontinuum dargestellt wird, bei dem jede Population unterschiedliche Eigenschaften und funktionelle Rollen im Ergebnis der Krankheitsentwicklung und progression4,5,6,7hat. Dennoch gibt es mit dem Makrophagenmodell M1/M2 zahlreiche experimentelle Vorteile, die in verschiedenen Forschungsbereichen eingesetzt werden können.
Mycobacterium tuberculosis (Mtb) ist der Erreger von Tuberkulose (TB) und wird geschätzt, um jede Sekunde eine Person zu infizieren und gilt als der tödlichste einzelne Infektionserreger der Welt (Global TB Report 2019). Da die Atemwege der Hauptweg der Mtb-Infektion sind, sind Alveolar-Makrophagen die bevorzugten Wirtszellen, die mit Mtb infiziert werden und sowohl die primären Barrieren als auch das infektiöse Reservoir für Mtb in der Lunge darstellen. Die Makrophagenpolarisation als Reaktion auf verschiedene Reize wurde im Laufe der Jahre7 ausgiebig untersucht und in den meisten veröffentlichten Arbeiten wird die M1-Polarisation von Monozytenkulturen in vitro durch Granulozyt-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) zusammen mit IFN-γ und LPS8,9induziert, während die M2-Polarisation mit Makrophagen-Kolonie-Stimulierenden Faktor (M-CSF) und IL-410induziertwird. Die M1-Makrophagen sind potente Effektorzellen, die antimikrobielle Reaktionen gegen intrazelluläre Krankheitserreger vermitteln und eine wesentliche Rolle bei der Antitumorimmunität12spielen. M2-Makrophagen hingegen haben eine entzündungshemmende Funktion, eine hohe phagozytische Kapazität und sind hauptsächlich an der Wundheilung und Gewebereparatur sowie an Parasiteninfektionenbeteiligt 12. Dementsprechend werden M1-Makrophagen als effektiver bei der intrazellulären Kontrolle von Mtb im Vergleich zu M2-Makrophagen13angesehen. Jedoch, Mtb Bakterien haben auch das Potenzial, Makrophagen Polarisation zu modulieren angeborene Immunität14,15,16,17zu unterwandern.
Während es üblich ist, Makrophagen aus der Differenzierung von Monozyten aus peripherem Blut18zu erzeugen, könnten Makrophagen auch aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs)19 oder aus Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen von Mäusen20,21erzeugt werden. Dies sind praktikable Techniken zur Untersuchung primärer Makrophagenzellen, die aus Monozyten-Makrophagen-Vorläufern gewonnen werden und sich vermehren und sich in eine homogene Population aus reifen Makrophagen-ähnlichen Zellen differenzieren. Diese Protokolle liefern jedoch selten vertieftes Wissen über den Phänotyp und die Funktion der erhaltenen Zellen und berücksichtigen auch nicht die natürliche Heterogenität, die bei den in vivo erhaltenen Makrophagen beobachtet wird. Da Mtb ein strenger menschlicher Erreger ist, gibt es auch einen Vorteil, Mtb in humanisierten Modellsystemen zu studieren. Durchflusszytometrie ist eine leistungsstarke Technologie, die die Möglichkeit bietet, mehrere phänotypische und funktionelle Eigenschaften einzelner Zellen in Suspension22zu bewerten, etwas, das ziemlich herausfordernd mit anhaftenden Zellen wie Makrophagen sein könnte, die auch als autofluoreszierend23,24bekannt sind. Neben der chemischen Ablösung fest anhaftender Makrophagen kann die Mtb-Infektion einen signifikanten Stressfaktor für die Zellen darstellen, der eine weitere Komplexität bei zytometrischen Flussanalysen von Mtb-infizierten Makrophagen hinzufügt.
In diesem experimentellen Protokoll haben wir ein zuvor etabliertes menschliches Makrophageninfektionsmodell verwendet, das auf der Immunpolarisation von primären peripheren Blutmonozyten-abgeleiteten Zellen basiert, die mit dem virulenten Labor-Mtb-Stamm H37Rv infiziert sind, und mit Durchflusszytometrie mit einem 10-Farben-Panel einschließlich expression ausgewählter M1- und M2-Marker25analysiert wurden. Dieses Protokoll bietet eine effiziente und reproduzierbare Methode, um Reaktionen auf Mtb-Infektionen in M1 oder M2 polarisierten Monozyten-abgeleiteten Makrophagen zu untersuchen. Darüber hinaus ermöglicht uns die Verwendung der Durchflusszytometrie an anhaftenden Mtb-infizierten Makrophagen, eine Vielzahl von Oberflächenmarkern zu untersuchen, die mit herkömmlichen M1- und M2-Makrophagen und deren Längsreaktion auf Mtb-Infektionen assoziiert sind. Wichtig ist, dass dieses Protokoll leicht für Untersuchungen von Infektionen mit anderen Krankheitserregern, in Anti-Tumor-Studien oder in Studien zu entzündlichen Erkrankungen, für Arzneimittelscreenings usw. übernommen werden kann und auch für die Beurteilung der M1/M2-Makrophagenpolarisation in menschlichen klinischen Proben genutzt werden könnte.
Dieses experimentelle Protokoll beschreibt die effektive Polarisation von myeloiden Zellen in M1- oder M2-Phänotypen, einschließlich der Bewertung mit einem 10-farbenigen Durchflusszytometrie-Panel, das die Visualisierung und Tiefencharakterisierung von GFP-beschrifteten Mtb in verschiedenen Makropages-Teilmengen ermöglicht. Obwohl TB eine alte menschliche Krankheit ist, gibt es derzeit kein goldenes Standardmodell, um Mtb-Makrophagen-Wechselwirkungen zu untersuchen, und die mehrfarbige Durchflusszytometrie von Makrophagen könnte im Vergleich zu Analysen von Lymphozytenreaktionen kompliziert sein. Wenige verfügbare Protokolle für die In-vitro-Differenzierung menschlicher Monozyten zu Makrophagen bieten tiefe Kenntnisse über die Art der erzeugten Makrophagen. Ein grundlegendes Protokoll zur Makrophagenpolarisation und zur zytometrischen Durchflussbewertung der Makrophagenaktivierung mit einem soliden Panel von Markern kann eine solche Charakterisierung wahrscheinlich erleichtern und Möglichkeiten bieten, zusätzliche Merkmale polarisierter Zellen zu untersuchen, die unter verschiedenen Bedingungen behandelt werden. Dazu gehören Analysen von in vitro kultivierten Zellen sowie Analysen von Zellen in vivo in klinischen Proben, d.h. sowohl PBMC- als auch einzellige Suspensionen aus Körperflüssigkeiten (d. h. bronchoalveolare Rinhalt) oder homogenisiertem Gewebe. Dementsprechend könnte die Differenzierung und/oder aktivierungsstatus von Monozyten und Makrophagen, die von Patienten erhalten wurden, mit dem Krankheitsergebnis zusammenhängen. Die Ausweitung von CD16+CD163+ Monozyten im peripheren Blut wurde bei Lungen-TB-Patienten30berichtet. Eine erhöhte Häufigkeit von CD163+ Zellen wurde auch in der entzündeten Haut von atopischen Dermatitis-Patienten31nachgewiesen. In ähnlicher Weise hemmen CD206+ M2-ähnliche Makrophagen die Proliferation und Differenzierung von Zellen in der Mikroumgebung von Adipozytengewebe32 und werden in Knochenmarkproben von Patienten mit akuter myeloischer Leukämie (AML)angereichert 29. Es wurde ein erhöhtes Verhältnis von CD64 (M1) zu CD163 (M2)-Zellen im Vollblut von Patienten mit Arthrose festgestellt, die mit der Schwere der Erkrankung in Verbindung gebrachtwerden. Eine andere Studie verwendete CD86 (M1) und CD163 (M2), um zu zeigen, dass eine hohe M1-Expression im Gewebe mit einem schlechteren Ergebnis in einer Untergruppe bösartiger Hirntumorenkorrelierte 34.
Dieses experimentelle M1/M2-Flow-Zytometrieprotokoll hat mehrere wesentliche Vorteile. Dieses Modell bietet die Möglichkeit, angeborene Immunantworten auf virulente Mtb-Infektionen zu untersuchen und kann entwickelt werden, um Studien über adaptive Immunantworten zu enthalten, indem autologe T-Zellen zusammen mit M1- oder M2-Makrophagen bei gemischten Lymphozytenreaktionen (MLRs) hinzugefügt werden. Das Protokoll eignet sich auch für das Screening und die Prüfung verschiedener immunmodulatorischer und antimikrobieller Verbindungen. Hier haben wir zuvor die Auswirkungen von Vitamin D und dem Histon-Deacetylase-Inhibitor Phenylbutyrat auf myeloiden-abgeleiteten Zellen nach Mtb-Infektion25,35untersucht. M1/M2 Durchflusszytometrie könnte auch verwendet werden, um Makrophagenaktivierung nach Derkonditionierung mit Zellkulturüberstand oder Patientenplasma zu bewerten. Während In-vivo-Studien zur TB-Koinfektion mit HIV oder Helminthen oder TB-Diabetes-Komorbidität eine Herausforderung darstellen könnten, kann das weniger komplexe M1/M2-Modell Studien über Komorbiditäten in vitro erleichtern. Ebenso könnte das Protokoll für Übertragungsstudien genutzt werden, um die Mtb-Infektionsfähigkeit von Zellen zu untersuchen oder phagozytische sowie Antigen-Präsentationskapazität einzelner M1/M2-Zellen zu untersuchen. Die M1/M2-Durchflusszytometrie ist auch für den Einsatz in Biomarker- und Impfstoffstudien attraktiv, um die Krankheitsprognose während der Behandlung zu verfolgen und Therapien zu testen, die auf myelooide Zellen abzielen. Wichtig ist, dass eine Reihe verschiedener Methoden parallel zur Durchflusszytometrie zur gleichzeitigen Bewertung von Makrophagenpolarisationsphänotypen und funktionellen Reaktionen mittels konfokaler Mikroskopie (Abbildung 3D), Echtzeit-PCR, Western Blot, Multiplex-Assays und ELISA von löslichen Faktoren im Kulturüberstand sowie Bewertung der intrazellulären bakteriellen Infektiosität und des Wachstums mittels GFP-Expression (Flow-Zytometrie und konfokale Mikroskopie) und koloniebildenden Einheiten (KBE). Die Infektion von M1- oder M2-Zellen mit Mtb-GFP-Bakterien ermöglicht auch die Sortierung der nicht infizierten und Mtb-infizierten Zellen aus derselben Probe für die Einzelzell-RNA-Sequenzierungsanalyse.
Das beschriebene Protokoll hat auch einige Einschränkungen, einschließlich technischer und wissenschaftlicher Nachteile. Der Nachteil bei Monozyten-abgeleiteten Makrophagen von menschlichen Blutspendern ist, dass die Variabilität der Spender oft hoch ist und die Tatsache, dass die Zellen in der physiologischen Umgebung menschlicher Gewebe nicht polarisiert sind. Eine große Variabilität der M1/M2-Polarisationswirksamkeit oder Mtb-Infektion zwischen Spendern kann zu Problemen sowohl mit intra- als auch mit interexperimentellen Schwankungen, geringer statistischer Leistung und der Notwendigkeit führen, viele Spender einzubeziehen, um zuverlässige Ergebnisse zu erzielen. Darüber hinaus führt die plastische Haftung von Monozyten von PBMCs zu einer spenderabhängigen Anzahl von Monozyten/Well, die schließlich eine willkürliche MOI liefern können, die die Makrophagenpolarisation und Zelllebensfähigkeit nach der Mtb-Infektion beeinträchtigen könnte. Kritische Schritte im Protokoll beinhalten eine ordnungsgemäße Wäsche, um zu verhindern, dass andere Zelltypen die Zellkulturen kontaminieren, die sich auch auf die Makrophagenpolarisation auswirken könnten. Während ein zu niedriger MOI latente TB-Infektion imitieren kann, wird ein zu hoher MOI die Zellen abtöten, was die Bedeutung der Verwendung eines geeigneten MOI unterstreicht. Darüber hinaus könnte es schwierig sein, fest anhaftende Zellen nach Ablösung abzurufen, was zu einer voreingenommenen Darstellung bestimmter Makrophagen-Teilmengen führen kann, die für Strömungszytometrie-Analysen verwendet werden. Ein entscheidender Schritt in der Strömungszytometrie-Analyse beinhaltet die richtige Verwendung von Perlenkompensationsmatrix und Negativkontrollen wie ungefärbte Zellen oder FMO (Fluoreszenz Minus One) Kontrollen, um eine korrekte manuelle Gating zu gewährleisten.
Eine weitere Einschränkung beinhaltet die Polarisation von Monozyten, die aus Blut und nicht aus der lokalen Gewebeumgebung gewonnen werden. Das Kennzeichen der menschlichen TB ist die Bildung von Granulomen in Mtb-infizierten Geweben und daher sollte die Immunpathologie bei TB bevorzugt an der lokalen Gewebestelle untersucht werden. Monozyten werden jedoch nach einer Entzündung/Infektion aus peripherem Blut in die Lunge rekrutiert, wo sich Zellen in Makrophagen in Gegenwart von entzündlichen Zytokinen wie GM-CSF12differenzieren können. Wichtig ist, dass es im physiologischen Milieu von Gewebe in vivo wahrscheinlich eine große Heterogenität der Makrophagenpolarisation gibt, einschließlich einer Mischung und verschiedenen Verhältnissen verschiedener M1- und M2-ähnlicher Makrophagenpopulationen, die zum Schicksal der TB-Infektion beitragen36. Wir haben bereits ein humanes organotypisches Lungengewebemodell entwickelt, das 3D-Studien der makrophagenvermittelten Granulombildung bei TB37ermöglicht. Es könnte interessant sein, das aktuelle M1/M2-Polarisationsprotokoll in Kombination mit dem Lungengewebemodell zu nutzen, um die TB-Granulombildung, effektalierende Funktionen und das M1/M2-Verhältnis im experimentellen Gewebe weiter zu untersuchen.
Dieses M1/M2-Flowzytometrie-Protokoll könnte leicht angepasst werden, um ein erweitertes Panel von myeloischen Markern enthalten, die für die Beurteilung von Merkmalen im Zusammenhang mit hemmenden sowie entzündlichen Reaktionen nützlich sind. Es gibt ein großes Forschungsinteresse an hemmenden Immun-Checkpoint-Molekülen wie PD-1, SIRP-α, IDO und Arginasen, die Makrophagen-Antworten modulieren könnten38. In diesem Zusammenhang könnte die Polarisation von myeloischen Zellen auch andere Reize beinhalten, die immunregulierende Makrophagen (Mreg) oder myeloiden-abgeleiteten Suppressorzellen (MDSC) fördern, die nachweislich an mehreren Krankheiten, einschließlich TB38, beteiligt sind. Erweiterte Durchflusszytometrie-Panels von M1/M2/Mreg-Makrophagen-Untergruppen können auch intrazelluläre Färbungen von Zytokinen/Chemokinen IL-1, TNF-α, IL-10 und MCP-1 oder anderen löslichen Faktoren oder Effektormolekülen wie induzieniblem Stickstoffmonoxid (iNOS) und antimikrobiellen Peptiden umfassen. Dies könnte die Möglichkeiten zur Untersuchung polyfunktioneller Makrophagenreaktionen verbessern, ähnlich dem, was für T-Zellen39ausführlich beschrieben wurde.
Derzeit können Strömungszytometrie-Färbeplatten bis zu 30-40 Farben enthalten, was die Möglichkeit bietet, mehrere Zell-Untergruppen und Moleküle gleichzeitig immunphenotypisieren zu können. Die grundlegende versuchsweise Einrichtung dieses M1/M2-Flow-Zytometrieprotokolls kann als Backbone verwendet werden, das sowohl mit den meisten alten als auch mit neuen Durchflusszytometern kompatibel ist und auf individuellen Bedürfnissen aufbauen und zugeschnitten werden kann, einschließlich der Herausforderungen, die sich aus der Arbeit mit dem virulenten Mtb in einer BSL-3-Umgebung ergeben. Heutzutage sind Dimensionalitätsreduktionstechniken wie UMAP in den neuen Versionen der Durchflusszytometrie-Software verfügbar, die die Analyse einer großen Anzahl von Parametern ermöglicht, die in einzelzelligen Studien generiert werden und für eine verbesserte Visualisierung und Interpretation hochdimensionaler Daten unerlässlich sind40. Die ständigen technologischen Verbesserungen in der Durchflusszytometrie werden sich wahrscheinlich in den kommenden Jahren fortsetzen, einschließlich der Kombination von multiparametrischer Phänotypisierung zusammen mit modernen Zellsortierungsfunktionen, bei denen sich dieses Protokoll bei mehreren Makrophagen-basierten Mtb-Infektionstests als nützlich erweisen könnte.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken unseren Kollegen von der schwedischen Gesundheitsbehörde Matilda Svensson und Solomon Ghebremichael für die Unterstützung im BSL-3-Labor.
Diese Arbeit wurde durch Stipendien der Schwedischen Herz- und Lungenstiftung (HLF) (2019-0299 und 2019-0302 an SB), des Schwedischen Forschungsrates (VR) (2014-02592, 2019-01744 und 2019-04720 an SB), die Stiftung zur Verhinderung von Antibiotikaresistenz (Widerstand), Karolinska Institutet Foundations und KID to SB (Teilfinanzierung der Promotion für Marco Loreti) vom Karolinska Institutet. ML wurde von der Schwedischen Kinderkrebsstiftung (TJ2018-0128 und PR2019-0100) unterstützt.
8-well chamber slides | Lab-Tek | 154534 | |
BD Comp bead plus | BD | 560497 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
DAPI Mounting media | Vector Laboratories | H-1200-10 | |
EDTA (0.5 M) | Karolinska University hospital, Huddinge | N/A | |
Falcon 6-well Flat Bottom plates | Corning Life Sciences | 353046 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
Glycerol (70%) | Karolinska University hospital, Huddinge | N/A | |
GM-CSF | Peprotech | 300-03 | |
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 594 secondary antibody | Invitrogen | R37121 | Secondary antibody for CD64 |
Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 594 secondary antibody | Invitrogen | A-11037 | Secondary antibody for CD163 |
HEPES | GE Healthcare Life Sciences | SH30237.01 | |
IFN-γ | Peprotech | 300-02 | |
IL-4 | Peprotech | 200-04 | |
L-Glutamine | GE Healthcare Life Sciences | SH30034.01 | |
LPS (Escherichia coli O55:B5) | Sigma-Aldrich | L6529 | |
Lymphoprep | Alere Technologies AS | 11508545 | |
M-CSF | Peprotech | 300-25 | |
Middle Brook 7H10 agar plates | Karolinska University hospital, Huddinge | N/A | |
Middle Brook 7H9 media | Karolinska University hospital, Huddinge | N/A | |
Mouse anti-human CD64 primary antibody | Bio-Rad | MCA756G | Clone: 10.1 |
Na-pyruvate | GE Healthcare Life Sciences | SH300239.01 | |
Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
Rabbit anti-human CD163 primary antibody | GeneTex | GTX81526 | Polyclonal |
RPMI 1640 | Life Technologies Corporation | SH30096.01 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X-100 | |
TubeSpin bioreactor tubes | TPP Techno Plastic Products AG | 87050 | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
Tween-80 | Sigma-Aldrich | P4780 |