El jugo pancreático es una fuente preciosa de biomarcadores para el cáncer de páncreas humano. Describimos aquí un método para el procedimiento de recolección intraoperatoria. Para superar el desafío de adoptar este procedimiento en modelos murinos, sugerimos una muestra alternativa, el líquido intersticial tumoral, y describimos aquí dos protocolos para su aislamiento.
El adenocarcinoma pancreático (PDAC) es la cuarta causa principal de muerte relacionada con el cáncer, y pronto se convertirá en la segunda. Existe una necesidad urgente de variables asociadas a patologías pancreáticas específicas para ayudar al diagnóstico diferencial preoperatorio y al perfil del paciente. El jugo pancreático es un fluido corporal relativamente inexplorado que, debido a su proximidad al sitio del tumor, refleja cambios en el tejido circundante. Aquí describimos en detalle el procedimiento de recolección intraoperatoria. Desafortunadamente, traducir la recolección de jugo pancreático a modelos murinos de PDAC, para realizar estudios mecanicistas, es técnicamente muy desafiante. El líquido intersticial tumoral (TIF) es el líquido extracelular, fuera de la sangre y el plasma, que baña las células tumorales y del estroma. Al igual que el jugo pancreático, por su propiedad de recolectar y concentrar moléculas que se encuentran diluidas en plasma, TIF puede ser explotado como un indicador de alteraciones microambientales y como una valiosa fuente de biomarcadores asociados a enfermedades. Dado que TIF no es fácilmente accesible, se han propuesto varias técnicas para su aislamiento. Describimos aquí dos métodos simples y técnicamente poco exigentes para su aislamiento: centrifugación tisular y elución tisular.
El adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) es uno de los tumores más agresivos y pronto se convertirá en la segunda causa de muerte 1,2,3. Es bien conocido por su microambiente inmunosupresor y por su falta de respuesta a los protocolos de inmunoterapia4. Actualmente, la resección quirúrgica sigue siendo la única opción curativa para el PDAC, sin embargo, hay una alta frecuencia de recaídas tempranas y complicaciones posquirúrgicas. La falta de síntomas específicos hasta una etapa avanzada no permite un diagnóstico precoz, contribuyendo a la caducidad de la enfermedad. Además, la superposición de síntomas entre PDAC y otras patologías pancreáticas benignas puede dificultar el logro de un diagnóstico rápido y confiable con las estrategias diagnósticas actuales. La identificación de variables asociadas a patologías pancreáticas específicas podría facilitar la toma de decisiones quirúrgicas y mejorar el perfil del paciente.
Se han logrado resultados prometedores en el descubrimiento de biomarcadores utilizando fluidos corporales de fácil acceso, como sangre 5,6,7, orina8, saliva 9 y jugo pancreático10,11,12. Muchos estudios han explotado enfoques integrales de “ómicas”, como técnicas genómicas, proteómicas y metabolómicas, para identificar moléculas candidatas o firmas que podrían discriminar entre PDAC y otras afecciones pancreáticas benignas. Recientemente demostramos que el jugo pancreático, un fluido corporal relativamente inexplorado, puede ser utilizado para identificar firmas metabólicas de pacientes con perfiles clínicos distintos12. El jugo pancreático es un líquido rico en proteínas, que acumula el secretoma de las células ductales pancreáticas y fluye hacia el conducto pancreático principal, y luego hacia el conducto biliar común principal. Debido a su proximidad al páncreas, podría verse fuertemente afectado por perturbaciones microambientales inducidas por la masa tumoral (Figura 1) y, por lo tanto, más informativo que la sangre o la orina, o el perfil basado en tejidos. Varios estudios han explorado el potencial del jugo pancreático para identificar nuevos biomarcadores de enfermedad utilizando diversos enfoques, incluyendo el análisis citológico 13, el análisis proteómico realizado por espectrometría de masas 14,15, la evaluación de marcadores genéticos y epigenéticos como las mutaciones K-ras y p53 16,17, alteraciones en la metilación del ADN 18 y miRNAs 19 . Técnicamente, el jugo pancreático puede ser recolectado intraoperatoriamente o con procedimientos mínimamente invasivos, como ultrasonido endoscópico, colangiopancreatografía retrógrada o por recolección endoscópica de secreción de jugo duodenal20. Todavía no está claro en qué medida la composición del jugo pancreático se ve afectada por la técnica de recolección utilizada. Describimos aquí el procedimiento de recolección intraoperatoria y mostramos que el jugo pancreático puede representar una fuente valiosa de biomarcadores PDAC.
Figura 1: Representación esquemática de la recolección de jugo pancreático. (A) Representación esquemática que representa la secreción de jugo pancreático en el conducto pancreático y su recolección durante la cirugía. El recuadro muestra un primer plano del microambiente tumoral: el jugo pancreático recoge moléculas liberadas por las células tumorales y estromales en los conductos pancreáticos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La recolección de jugo pancreático en modelos genéticos y ortotópicos de ratón de PDAC sería apreciada en la perspectiva de explotar este biofluido en estudios mecanicistas preclínicos; Sin embargo, este procedimiento puede ser técnicamente muy desafiante y no es factible para modelos más simples, como los tumores subcutáneos. Por esta razón, identificamos el líquido intersticial tumoral (TIF) como una fuente alternativa al jugo pancreático, por su característica similar de actuar como un indicador de perturbaciones circundantes. El líquido intersticial (IF) es el líquido extracelular, que se encuentra fuera de los vasos sanguíneos y linfáticos, que baña las células tisulares21. La composición del FI se ve afectada tanto por la circulación sanguínea al órgano como por la secreción local; de hecho, las células circundantes producen y secretan activamente proteínas en el IF21. El intersticio refleja los cambios microambientales de los tejidos circundantes y, por lo tanto, podría representar una fuente valiosa para el descubrimiento de biomarcadores en varios contextos patológicos, como los tumores. La alta concentración de proteínas secretadas localmente en TIF puede ser utilizada para identificar moléculas candidatas para ser probadas como biomarcadores pronósticos o diagnósticos en plasma22,23,24. Varios estudios han demostrado que TIF es una muestra adecuada para enfoques proteómicos de alto rendimiento, como las técnicas de espectrometría de masas 23,24,25, así como los enfoques ELISA multiplex 26 y el perfil de microARN 27.
Se han propuesto varios enfoques para el aislamiento del AI en tumores, que pueden clasificarse ampliamente como in vivo (ultrafiltración capilar 28,29,30,31 y microdiálisis 32,33,34,35) y métodos ex vivo (centrifugación tisular 22,36,37,38 y elución tisular 39,40,41,42). Estas técnicas han sido revisadas con gran detalle43,44. La elección del método adecuado debe tener en cuenta cuestiones como los análisis y aplicaciones posteriores y el volumen recuperado. Recientemente utilizamos este enfoque como prueba de principio para demostrar la diferente actividad metabólica de los tumores de dos líneas celulares murinas de adenocarcinoma pancreático12. Con base en la literatura24,38, optamos por utilizar el método de centrifugación de baja velocidad para evitar la rotura celular y la dilución del contenido intracelular. Tanto la cantidad de glucosa como de lactato en TIF reflejaban las diferentes características glucolíticas de las dos líneas celulares diferentes. Aquí describimos en detalle el protocolo para los dos métodos más utilizados para el aislamiento de TIF: centrifugación tisular y elución tisular (Figura 2).
Figura 2: Representación esquemática de los métodos de aislamiento del líquido intersticial tumoral. Ilustración esquemática de las técnicas descritas en detalle en el protocolo, a saber, centrifugación tisular (A) y elución tisular (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
En este estudio hemos descrito la técnica para recolectar intraoperatoriamente jugo pancreático, una biopsia de líquido en gran parte inexplorada. Recientemente hemos demostrado que el jugo pancreático puede ser explotado como fuente de marcadores metabólicos de la enfermedad12. El análisis metabolómico en otras biopsias líquidas, como sangre 5,6,7, orina8 y saliva9,<sup cl…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Roberta Migliore por su asistencia técnica. La investigación que condujo a estos resultados ha recibido financiación de la Associazione Italiana per la ricerca sul cancro (AIRC) bajo el proyecto IG2016-ID.18443 – P.I. Marchesi Federica. Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.
1 mL syringe | BD Biosciences | 309659 | |
1.5 mL Eppendorf tube | Greiner BioOne | GR616201 | |
20 µm nylon cell strainer | pluriSelect | 43-50020-03 | |
25G needle | BD Biosciences | 305122 | |
3 mL K2EDTA vacutainer | BD Biosciences | 366473 | |
3 mL syringe | BD Biosciences | 309656 | |
50 mL Falcon tube | Corning | 352098 | |
Clamps | Medicon | 06.20.12 | |
Disposable scalpel | Medicom | 9000-10 | |
Fetal bovine serum | Microtech | MG10432 | |
Flat-tipped forceps | Medicon | 06.00.10 | |
Penicillin-Streptomycin | Lonza | ECB3001D | |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
Protease inhibitor cocktail | Roche | 34044100 | |
RPMI medium | Euroclone | ECB9006L | |
Scissors | Medicon | 02.04.09 | |
Trypsin/EDTA 1x | Lonza | BE17-161F | |
Ultraglutamine 100x | Lonza | BE17-605E/U1 |