מיץ לבלב הוא מקור יקר של סמנים ביולוגיים לסרטן הלבלב האנושי. אנו מתארים כאן שיטה להליך איסוף תוך ניתוחי. כדי להתגבר על האתגר של אימוץ הליך זה במודלים של מורין, אנו מציעים דגימה חלופית, נוזל אינטרסטיציאלי של הגידול, ומתארים כאן שני פרוטוקולים לבידודו.
אדנוקרצינומה של הלבלב (PDAC) היא הגורם הרביעי המוביל למוות הקשור לסרטן, ובקרוב תהפוך לשנייה. קיים צורך דחוף במשתנים הקשורים לפתולוגיות לבלב ספציפיות כדי לסייע באבחון דיפרנציאלי לפני הניתוח ובפרופיל המטופל. מיץ הלבלב הוא נוזל גוף שלא נחקר יחסית, אשר, בשל קרבתו לאתר הגידול, משקף שינויים ברקמה הסובבת. כאן אנו מתארים בפירוט את הליך האיסוף תוך ניתוחי. למרבה הצער, תרגום איסוף מיץ הלבלב למודלים של PDAC, לביצוע מחקרים מכניסטיים, הוא מאתגר מאוד מבחינה טכנית. הנוזל הבין-תאי של הגידול (TIF) הוא הנוזל החוץ-תאי, מחוץ לדם ולפלזמה, אשר שוטף את תאי הגידול והסטרומל. בדומה למיץ הלבלב, עבור התכונה שלו לאסוף ולרכז מולקולות שנמצאות מדולל בפלזמה, TIF יכול להיות מנוצל כאינדיקטור לשינויים מיקרו-סביבתיים וכמקור רב ערך של סמנים ביולוגיים הקשורים למחלות. מכיוון ש- TIF אינו נגיש בקלות, הוצעו טכניקות שונות לבידודו. אנו מתארים כאן שתי שיטות פשוטות ובלתי תובעניות מבחינה טכנית לבידודה: צנטריפוגה של רקמות והרחבת רקמות.
אדנוקרצינומה של צינור הלבלב (PDAC) היא אחד הגידולים האגרסיביים ביותר, ובקרוב תהפוך לסיבתהמוות השנייה המובילה 1,2,3. הוא ידוע במיקרו-סביבה המדכאת את מערכת החיסון שלו ובחוסר התגובה שלו לפרוטוקולים אימונותרפיים4. נכון לעכשיו, כריתה כירורגית היא עדיין האפשרות המרפאת היחידה עבור PDAC, ובכל זאת יש תדירות גבוהה של הישנות מוקדמת וסיבוכים לאחר ניתוח. היעדר סימפטומים ספציפיים עד שלב מתקדם אינו מאפשר אבחון מוקדם, תורם למועדי המחלה. יתר על כן, החפיפה של הסימפטומים בין PDAC לבין פתולוגיות לבלב שפירות אחרות יכולה לעכב את ההישג של אבחנה מהירה ואמינה עם אסטרטגיות האבחון הנוכחיות. זיהוי משתנים הקשורים לפתולוגיות לבלב ספציפיות יכול להקל על תהליך קבלת ההחלטות הכירורגיות ולשפר את פרופיל המטופל.
תוצאות מבטיחות בגילוי סמנים ביולוגיים הושגו באמצעות נוזלי גוף נגישים בקלות, כגון דם 5,6,7, שתן 8, רוק9 ומיץ לבלב10,11,12. מחקרים רבים ניצלו גישות מקיפות של “אומיקה”, כגון טכניקות גנומיות, פרוטאומיות ומטבולומיות, כדי לזהות מולקולות או חתימות מועמדות שיכולות להבחין בין PDAC לבין פגיעות לבלב שפירות אחרות. לאחרונה הדגמנו כי ניתן להשתמש במיץ לבלב, נוזל גוף שטרם נחקר באופן יחסי, כדי לזהות חתימות מטבוליות של מטופלים עם פרופילים קליניים שונים12. מיץ הלבלב הוא נוזל עשיר בחלבון, אשר צובר את הפרשת תאי צינור הלבלב וזורם לצינור הלבלב הראשי, ולאחר מכן לצינור המרה המשותף העיקרי. בשל קרבתו ללבלב, הוא עשוי להיות מושפע מאוד מהפרעות מיקרו-סביבתיות המושרות על-ידי מסת הגידול (איור 1), ולכן הוא אינפורמטיבי יותר מדם או שתן, או פרופיל מבוסס רקמות. מספר מחקרים בחנו את הפוטנציאל של מיץ לבלב לזהות סמנים ביולוגיים חדשים של מחלות באמצעות גישות שונות, כולל ניתוח ציטולוגי 13, אנליזה פרוטאומית המבוצעת על ידי ספקטרומטריית מסה 14,15, הערכת סמנים גנטיים ואפיגנטיים כגון מוטציות K-ras ו-p53 16,17, שינויים במתילציה של DNA18, ו-miRNAs 19 . מבחינה טכנית, מיץ הלבלב ניתן לאסוף תוך ניתוחי או עם הליכים פולשניים מינימליים, כגון אולטרסאונד אנדוסקופי, cholangio-panracegraphy retrograde, או על ידי אוסף אנדוסקופי של הפרשת מיץ התריסריון20. עדיין לא ברור באיזו מידה הרכב מיץ הלבלב מושפע מטכניקת האיסוף המשמשת. אנו מתארים כאן את הליך האיסוף התוך-ניתוחי ומראים כי מיץ הלבלב יכול להוות מקור יקר ערך לסמנים ביולוגיים של PDAC.
איור 1: ייצוג סכמטי של איסוף מיץ הלבלב. (A) ייצוג סכמטי המתאר את הפרשת מיץ הלבלב לצינור הלבלב ואיסופו במהלך הניתוח. הכניסה מראה תקריב של המיקרו-סביבה של הגידול: מיץ הלבלב אוסף מולקולות המשוחררות על ידי תאים סרטניים וסטרומליים בצינורות הלבלב. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
אוסף מיץ הלבלב במודלים גנטיים ואורתוטופיים של עכברים PDAC יהיה מוערך בפרספקטיבה כדי לנצל את זה biofluid במחקרים מכניסטיים פרה-קליניים; עם זאת, הליך זה יכול להיות מאתגר מאוד מבחינה טכנית ואינו אפשרי עבור מודלים פשוטים יותר כגון גידולים תת עוריים. מסיבה זו, זיהינו נוזל אינטרסטיציאלי של הגידול (TIF) כמקור חלופי למיץ הלבלב, בגלל המאפיין הדומה שלו לפעול כאינדיקטור להפרעות בסביבה. נוזל אינטרסטיציאלי (IF) הוא הנוזל החוץ-תאי, הנמצא מחוץ לכלי הדם והלימפה, אשר שוטף תאי רקמה21. הרכב IF מושפע הן ממחזור הדם לאיבר והן מהפרשה מקומית; למעשה, התאים הסובבים מייצרים ומפרישים חלבונים באופן פעיל ב-IF21. האינטרסטיטיום משקף שינויים מיקרו-סביבתיים של הרקמות הסובבות ולכן יכול להוות מקור רב ערך לגילוי סמנים ביולוגיים במספר הקשרים פתולוגיים, כגון גידולים. הריכוז הגבוה של חלבונים מופרשים מקומית ב- TIF יכול לשמש לזיהוי מולקולות מועמדות להיבדק כסמנים ביולוגיים פרוגנוסטיים או אבחנתיים בפלזמה22,23,24. מספר מחקרים הוכיחו כי TIF הוא מדגם מתאים לגישות פרוטאומיות בעלות תפוקה גבוהה, כגון טכניקות ספקטרומטריית מסות23,24,25, כמו גם גישות ELISA מולטיפלקס26, ופרופיל מיקרו-רנ”א 27.
מספר גישות הוצעו לבידוד של IF בגידולים, אשר ניתן לסווג באופן רחב כמו in vivo (אולטרה סינון נימי 28,29,30,31 ומיקרודיאליזה 32,33,34,35) ושיטות ex vivo (צנטריפוגה רקמה 22,36,37,38 ו רקמות elution 39,40,41,42). טכניקות אלה נסקרו בפירוט רב43,44. הבחירה בשיטה המתאימה צריכה לקחת בחשבון סוגיות כגון ניתוחים ויישומים במורד הזרם והנפח שהתאושש. לאחרונה השתמשנו בגישה זו כהוכחה עקרונית כדי להדגים את הפעילות המטבולית השונה של גידולים משני קווי אדנוקרצינומה של לבלב12. בהתבסס על ספרות24,38, בחרנו להשתמש בשיטת הצנטריפוגה במהירות נמוכה כדי למנוע שבירה ודילול של תאים מתוכן תוך-תאי. גם כמות הגלוקוז וגם הלקטט ב-TIF שיקפו את המאפיינים הגליקוליטיים השונים של שני קווי התאים השונים. כאן נתאר בפירוט את הפרוטוקול של שתי השיטות הנפוצות ביותר לבידוד של TIF: צנטריפוגה של רקמות ואלוציה של רקמות (איור 2).
איור 2: ייצוג סכמטי של שיטות לבידוד נוזלים אינטרסטיציאליים של גידולים. המחשה סכמטית של הטכניקות המתוארות בפירוט בפרוטוקול, כלומר צנטריפוגה של רקמות (A) ואלקטרוגציה של רקמות (B). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
במחקר זה תיארנו את הטכניקה לאיסוף תוך-ניתוחי של מיץ הלבלב, ביופסיה נוזלית שטרם נחקרה ברובה. לאחרונה הראינו כי מיץ הלבלב יכול להיות מנוצל כמקור סמנים מטבוליים של מחלה12. ניתוח מטבולי של ביופסיות נוזליות אחרות, כגון דם 5,6,7, שתן <su…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים לרוברטה מיליורה על הסיוע הטכני. המחקר שהוביל לתוצאות אלה קיבל מימון מ- Associazione Italiana per la ricerca sul cancro (AIRC) במסגרת פרויקט IG2016-ID.18443 – P.I. Marchesi Federica. למממנים לא היה כל תפקיד בתכנון המחקר, באיסוף הנתונים ובניתוחם, בהחלטה על הוצאתם לאור או בהכנת כתב היד.
1 mL syringe | BD Biosciences | 309659 | |
1.5 mL Eppendorf tube | Greiner BioOne | GR616201 | |
20 µm nylon cell strainer | pluriSelect | 43-50020-03 | |
25G needle | BD Biosciences | 305122 | |
3 mL K2EDTA vacutainer | BD Biosciences | 366473 | |
3 mL syringe | BD Biosciences | 309656 | |
50 mL Falcon tube | Corning | 352098 | |
Clamps | Medicon | 06.20.12 | |
Disposable scalpel | Medicom | 9000-10 | |
Fetal bovine serum | Microtech | MG10432 | |
Flat-tipped forceps | Medicon | 06.00.10 | |
Penicillin-Streptomycin | Lonza | ECB3001D | |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
Protease inhibitor cocktail | Roche | 34044100 | |
RPMI medium | Euroclone | ECB9006L | |
Scissors | Medicon | 02.04.09 | |
Trypsin/EDTA 1x | Lonza | BE17-161F | |
Ultraglutamine 100x | Lonza | BE17-605E/U1 |