Панкреатический сок является ценным источником биомаркеров рака поджелудочной железы человека. Здесь описан метод интраоперационной процедуры сбора. Чтобы преодолеть проблему принятия этой процедуры в мышиных моделях, мы предлагаем альтернативный образец, опухолевую интерстициальную жидкость, и описываем здесь два протокола для ее выделения.
Аденокарцинома поджелудочной железы (PDAC) является четвертой по значимости причиной смерти, связанной с раком, и вскоре станет второй. Существует острая потребность в переменных, связанных со специфическими патологиями поджелудочной железы, чтобы помочь предоперационной дифференциальной диагностике и профилированию пациентов. Панкреатический сок представляет собой относительно неисследованную жидкость организма, которая благодаря своей непосредственной близости к месту опухоли отражает изменения в окружающих тканях. Здесь мы подробно опишем процедуру интраоперационного сбора. К сожалению, перевод сбора панкреатического сока на мышиные модели PDAC для выполнения механистических исследований технически очень сложен. Опухолевая интерстициальная жидкость (TIF) представляет собой внеклеточную жидкость, находящуюся вне крови и плазмы, которая омывает опухолевые и стромальные клетки. Подобно соку поджелудочной железы, из-за его свойства собирать и концентрировать молекулы, которые находятся разбавленными в плазме, TIF может использоваться в качестве индикатора микроокружающих изменений и в качестве ценного источника биомаркеров, связанных с заболеванием. Поскольку TIF не является легкодоступным, были предложены различные методы его изоляции. Здесь мы опишем два простых и технически нетребовательных метода его выделения: тканевое центрифугирование и тканевое элюирование.
Аденокарцинома протоков поджелудочной железы (PDAC) является одной из самых агрессивных опухолей, и вскоре станет второй по значимости причиной смерти 1,2,3. Он хорошо известен своей иммуносупрессивной микросредой и своей неспособностью реагировать на протоколы иммунотерапии4. В настоящее время хирургическая резекция по-прежнему является единственным лечебным вариантом для PDAC, но существует высокая частота ранних рецидивов и послеоперационных осложнений. Отсутствие специфических симптомов до запущенной стадии не позволяет провести раннюю диагностику, способствуя срокам заболевания. Кроме того, перекрытие симптомов между PDAC и другими доброкачественными патологиями поджелудочной железы может препятствовать достижению быстрой и надежной диагностики с текущими диагностическими стратегиями. Идентификация переменных, связанных с конкретными патологиями поджелудочной железы, может облегчить процесс принятия хирургических решений и улучшить профилирование пациентов.
Многообещающие результаты в открытии биомаркеров были достигнуты с использованием легкодоступных жидкостей организма, таких как кровь 5,6,7, моча8, слюна9 и панкреатический сок 10,11,12. Во многих исследованиях использовались комплексные «омические» подходы, такие как геномные, протеомные и метаболомные методы, для идентификации молекул-кандидатов или сигнатур, которые могут различать PDAC и другие доброкачественные заболевания поджелудочной железы. Недавно мы продемонстрировали, что панкреатический сок, относительно неисследованная жидкость организма, может быть использован для идентификации метаболических сигнатур пациентов с различными клиническими профилями12. Панкреатический сок представляет собой богатую белком жидкость, которая накапливает секретом клеток протоков поджелудочной железы и поступает в главный проток поджелудочной железы, а затем в основной общий желчный проток. Из-за своей близости к поджелудочной железе на него могут сильно влиять микроокружательные возмущения, индуцированные опухолевой массой (рисунок 1), и, следовательно, более информативные, чем кровь или моча, или профилирование на основе тканей. В нескольких исследованиях изучался потенциал панкреатического сока для выявления новых биомаркеров заболевания с использованием различных подходов, включая цитологический анализ13, протеомный анализ, выполненный масс-спектрометрией 14,15, оценку генетических и эпигенетических маркеров, таких как мутации K-ras и p53 16,17, изменения в метилировании ДНК18 и миРНК 19 . Технически панкреатический сок может быть собран интраоперационно или с помощью минимально инвазивных процедур, таких как эндоскопическое ультразвуковое исследование, ретроградная холангио-панкреатография или эндоскопический сбор секреции дуоденального сока20. Пока не ясно, в какой степени на состав панкреатического сока влияет используемая методика сбора. Мы описываем здесь процедуру интраоперационного сбора и показываем, что панкреатический сок может представлять собой ценный источник биомаркеров PDAC.
Рисунок 1: Схематическое изображение сбора сока поджелудочной железы. (А) Схематическое изображение, изображающее секрецию панкреатического сока в проток поджелудочной железы и его сбор во время операции. Вставка показывает крупный план микроокружения опухоли: панкреатический сок собирает молекулы, высвобождаемые опухолевыми и стромальными клетками в протоках поджелудочной железы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Коллекция панкреатического сока в генетических и ортотопических мышиных моделях PDAC была бы оценена в перспективе использования этой биожидкости в доклинических механистических исследованиях; однако эта процедура может быть технически очень сложной и неосуществимой для более простых моделей, таких как подкожные опухоли. По этой причине мы идентифицировали опухолевую интерстициальную жидкость (TIF) в качестве альтернативного источника панкреатического сока, поскольку она сходная характеристика действует как индикатор окружающих возмущений. Интерстициальная жидкость (ИФ) представляет собой внеклеточную жидкость, обнаруженную вне кровеносных и лимфатических сосудов, которая омывает клеткиткани 21. На состав ПЧ влияет как кровообращение в органе, так и местная секреция; фактически, окружающие клетки активно продуцируют и секретируют белки в IF21. Интерстиций отражает микроокружательные изменения окружающих тканей и, следовательно, может представлять собой ценный источник для обнаружения биомаркеров в нескольких патологических контекстах, таких как опухоли. Высокая концентрация локально секретируемых белков в TIF может быть использована для идентификации молекул-кандидатов для тестирования в качестве прогностических или диагностических биомаркеров в плазме 22,23,24. Несколько исследований доказали, что TIF является подходящим образцом для высокопроизводительных протеомных подходов, таких как методы масс-спектрометрии23,24,25, а также мультиплексные подходы ИФА26 и профилирование микроРНК27.
Было предложено несколько подходов к выделению МФ в опухолях, которые можно в широком смысле классифицировать как in vivo (капиллярная ультрафильтрация 28,29,30,31 и микродиализ 32,33,34,35) и методы ex vivo (тканевая центрифугирование 22,36,37,38 и тканевое элюирование 39,40,41,42). Эти методы были подробно рассмотрены43,44. При выборе соответствующего метода следует учитывать такие вопросы, как последующий анализ и применение, а также восстановленный объем. Недавно мы использовали этот подход в качестве доказательства принципа для демонстрации различной метаболической активности опухолей из двух клеточных линий аденокарциномы мышей поджелудочной железы12. Основываясь на литературе24,38, мы решили использовать метод центрифугирования с низкой скоростью, чтобы избежать разрушения и разбавления клеток от внутриклеточного содержимого. Как количество глюкозы, так и лактата в TIF отражало различные гликолитические характеристики двух разных клеточных линий. Здесь мы подробно опишем протокол для двух наиболее часто используемых методов выделения TIF: тканевого центрифугирования и тканевого элюирования (рисунок 2).
Рисунок 2: Схематическое изображение методов выделения опухолевой интерстициальной жидкости. Схематическая иллюстрация методов, подробно описанных в протоколе, а именно центрифугирования тканей (А) и тканевого элюирования (В). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
В этом исследовании мы описали технику интраоперационного сбора сока поджелудочной железы, в значительной степени неисследованную жидкую биопсию. Недавно мы показали, что панкреатический сок может быть использован в качестве источника метаболических маркеров заболевания12…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Роберту Мильоре за техническую помощь. Исследование, приведшее к этим результатам, получило финансирование от Associazione Italiana per la ricerca sul cancro (AIRC) в рамках проекта IG2016-ID.18443 – P.I. Marchesi Federica. Спонсоры не играли никакой роли в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.
1 mL syringe | BD Biosciences | 309659 | |
1.5 mL Eppendorf tube | Greiner BioOne | GR616201 | |
20 µm nylon cell strainer | pluriSelect | 43-50020-03 | |
25G needle | BD Biosciences | 305122 | |
3 mL K2EDTA vacutainer | BD Biosciences | 366473 | |
3 mL syringe | BD Biosciences | 309656 | |
50 mL Falcon tube | Corning | 352098 | |
Clamps | Medicon | 06.20.12 | |
Disposable scalpel | Medicom | 9000-10 | |
Fetal bovine serum | Microtech | MG10432 | |
Flat-tipped forceps | Medicon | 06.00.10 | |
Penicillin-Streptomycin | Lonza | ECB3001D | |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
Protease inhibitor cocktail | Roche | 34044100 | |
RPMI medium | Euroclone | ECB9006L | |
Scissors | Medicon | 02.04.09 | |
Trypsin/EDTA 1x | Lonza | BE17-161F | |
Ultraglutamine 100x | Lonza | BE17-605E/U1 |