Этот протокол представляет собой рабочий процесс для суб-мм 2D визуализации нескольких половых неорганических питательных веществ и загрязняющих солют видов с использованием диффузных градиентов в тонких пленках (DGT) в сочетании с масс-спектрометрии изображений. Солутный отбор проб и химический анализ высокого разрешения подробно описаны для количественного картирования растворов в корневищах наземных растений.
Мы описываем метод двухмерной (2D) визуализации и количественной оценки распределения половых (т.е. обратимо адсорбных) неорганических питательных веществ (например, P, Fe, Mn) и загрязняющих (например, As, Cd, Pb) растворимых видов в почве, прилегающей к корням растений (ризосфера) в субмиллиметре. Метод сочетает в себе растворимую выборку на основе раковины диффузными градиентами в тонких пленках (DGT) с пространственно разрешенным химическим анализом путем лазерной абляции, индуктивно соединенной плазменной масс-спектрометрией (LA-ICP-MS). Техника DGT основана на тонких гидрогелях с однородно распределенными аналитно-селективными фазами связывания. Разнообразие доступных фаз связывания позволяет готовить различные типы геля DGT после простых процедур изготовления геля. Для развертывания геля DGT в ризосфере растения выращиваются в плоских прозрачных контейнерах роста (ризотронах), которые обеспечивают минимальный инвазивный доступ к почвенной корневой системе. После периода предварительного роста гели DGT применяются к отдельным регионам, представляющим интерес для отбора проб на месте в корневищах. После этого гели DGT извлекаются и готовятся к последующему химическому анализу связанных растворов с помощью изображений линии LA-ICP-MS. Применение внутренней нормализации с использованием 13C и внешней калибровки с использованием матричных стандартов геля также позволяет количественно определить 2D растворимые потоки. Этот метод уникален своей способностью генерировать количественные, суб-мм масштабные 2D-изображения многоэкторных растворимых потоков в почвенной среде, значительно превышающих достижимое пространственное разрешение других методов измерения растворимых градиентов в корневой среде. Мы представляем применение и оценку метода визуализации нескольких катионных и анионных растворимых видов в корневищах наземных растений и подчеркиваем возможность объединения этого метода с дополнительными методами солютной визуализации.
Приобретение питательных веществ растениеводствами является ключевым фактором в определении урожайности. Процессы, регулирующие эффективное поглощение питательных веществ сельскохозяйственными культурами, были тщательно изучены, особенно механизмы контроля за доступностью питательных веществ и интернализации питательных веществ корнями растений в почве-корневом интерфейсе, ризосфере, признаются за их роль в приобретении питательных веществ для сельскохозяйственных культур. Важные процессы поглощения питательных веществ в растениях включают: транспортировку питательных веществ к корню; динамическая уравновешенность между видами, растворенными в почве, и видами, связанными с твердыми почвенными поверхностями; микробная конкуренция за питательные вещества; микробная минерализация питательных веществ, содержащихся в органическом веществе почвы; и интернализация питательных веществ в корневую симплазму. Поглощение неорганических следов металлических (oid) загрязняющих веществ в значительной степени контролируется теми же механизмами.
В зависимости от наличия питательных веществ и загрязняющих веществ, спроса на растения и диффузии в почве можно наблюдать дифференциальные питательные вещества в ризосфере. Для сильно сорбяющих элементов со сравнительно высокими показателями интернализации (например, P, Fe, Mn, n, As, Cd, Pb), происходит истощение половых губ (т.е. обратимо адсорбированная) фракция элемента по сравнению с навалом почвы, при этом ширина зоны истощения часто составляет ≤1 мм, в то время как для более мобильных питательных веществ, таких как NO3–,зоны истощения могут простираться до нескольких сантиметров. Кроме того, накопление таких элементов, как Al и Cd наблюдается, когда доступность превышает уровень поглощения растений2,3.
Учитывая важность процессов ризосферы в питательных и загрязняющих велосипеде, несколько методов для измерения растительно-доступной фракции элемента при высоком пространственномразрешении были разработаны 4,5. Тем не менее, измерение мелкомасштабных половых растворимых дистрибутивов оказалось сложным по нескольким причинам. Основная трудность заключается в том, чтобы отведать очень небольшие (низкий диапазон йЛ) объемы почвы и/или поры в определенных положениях, прилегающих к живым корням растений, для решения крутых градиентов питательных веществ в корневищах. Один из подходов к решению этой проблемы заключается в использовании микро-всасывания чашки для извлечения образцовпоры 6. С помощью этого метода А. Гёттлин, А. Хейм иЭ. Мацнер 7 измеряли концентрацию питательных веществ в почве в непосредственной близости от корней Кверк-робура L. при пространственном разрешении 1 см. Трудность анализа объемов почвы или почвы заключается в том, что эти небольшие объемы выборки в сочетании с низкими концентрациями всех, кроме основных видов питательных веществ, требуют весьма чувствительных методов химического анализа.
Альтернативная система, способная разрешать градиенты питательных веществ с разрешением до 0,5 мм, заключается в том, чтобы вырастить корневой коврик на поверхности блока почвы, с тонким гидрофильных мембранный слой, отделяющий почву откорней 8,9. В этой конфигурации растворы могут проходить через мембрану и корни могут принимать питательные вещества и загрязняющие вещества из почвы, в то время как корневые экссудаты могут распространяться в почву. После создания плотного корневого слоя почвенный блок можно отведать и нарезать полученными образцами почвы для последующей извлечения фракций стихии. Таким образом, можно анализировать одномерные питательные вещества и загрязняющие градиенты, усредняя их на относительнобольшой площади (100 см 2).
Еще одна задача состоит в том, чтобы получить образцы лабильной, растительной фракции элемента, так как большинство методов извлечения химических почв работают очень по-разному по сравнению с механизмами, с помощью которых растения принимают питательные вещества и загрязняющие вещества. Во многих протоколах извлечения почвы почва смешивается с экстрактантным раствором с целью установления (псевдо)равновесия между растворенным и сорбированная фракция элемента. Однако растения постоянно интернализируют питательные вещества и, следовательно, часто постепенно истощают корневища почвы. Хотя протоколы равновесной добычи были широко приняты в качестве почвенных тестов, поскольку они просты в реализации, извлеченная питательная фракция часто не представляет собой доступную для растений питательнуюфракцию хорошо 10,11,12,13. Методы раковины, которые постоянно истощают отобранную почву для питательныхвеществ,были предложены в качестве выгодных методов и могут лучше напоминать основной механизм поглощения питательных веществ,имитируя процессы поглощения корней 10,11,14,15.
В дополнение к описанным выше методам, были разработаны подлинные приложения для визуализации, способные измерять непрерывные карты параметров с разрешениями ≤100 мкм пополям зрения нескольких см 2 для конкретных элементов и химических параметров почвы(био) 5. Авторадиография может быть использована для изображения распределения элементов в корневищах при условии, что подходящие радиоизотопыдоступны 16. Планарные оптоды позволяют визуализировать важные химические параметрыпочвы, такиекак рН и pO 217,18, 19,и активность ферментовили общее распределение белка могут быть отображены с помощью флуоресцентных методов визуализациииндикатора, таких как почвенная зимография 20,21,22,23 и/или корневыеметоды blotting 24. В то время как цымография и ауторадиография ограничиваются измерением одного параметра одновременно, pH и pO2 изображения с использованием планарных оптодов могут быть сделаны одновременно. Более традиционные методы корневого коврика предоставляют только 1D-информацию, в то время как чашки микро-всасывания обеспечивают точечные измерения или 2D-информацию с низким разрешением, однако оба подхода позволяют проводить многоэтакторный анализ. Совсем недавно, P. D. Ilhardt, и др.25 представил новый подход с использованием лазерной индуцированной спектроскопии разбивки (LIBS) для карты 2D общего многоу элемента распределения с разрешением 100 мкм в почве корневой основе образцов, где распределение природных элементов было сохранено тщательной подготовки образца.
Единственный метод, способный целевой 2D выборки нескольких питательных веществ и загрязняющих растворов при высоком пространственном разрешении диффузивных градиентов в тонких пленках (DGT) техники, раковина основе метода отбора проб, который обездвиживает половых следов металла (лоид) видов на месте на связывающий материал, встроенныйв гидрогель слой 26,27. DGT был введен в качестве метода химического видообразования для измерения половых растворов в отложениях и водах, и вскоре был принят для его использования в почвах28. Он позволяет суб-мм масштаба много элемента растворимой визуализации, которая была первоначальнопродемонстрирована в речном отложениях 29, и была разработана далее для его применения вкорневищах растений 30,31,32,33.
Для отбора проб DGT гель размером примерно 3 см х 5 см наносится на один корень растения, который растет в поверхностном слое почвы блока, с гидрофильной мембраной, отделяющей гель от почвы. Во время контакта питательные вещества и/или загрязняющие вещества рассеиваются по отношению к гелю и немедленно связываются связывающим материалом, включенным в гель. Таким образом, градиент концентрации, и, таким образом, непрерывный чистый поток к гелю устанавливается и преобладает во время отбора проб. После отбора проб гидрогель можно удалить и проанализировать с помощью аналитического химического метода, позволяющего пространственно разрешить анализ. Высокоспециализированной и часто используемой техникой для этой цели является лазерная абляция, индуктивно соединенная плазменная масс-спектрометрия (LA-ICP-MS). В некоторых ранних исследованиях, микрочастицы индуцированной рентгеновского излучения (PIXE) также был использован29. Выборка DGT в сочетании с анализом LA-ICP-MS позволяет осуществлять многофакторную химическую визуализацию при пространственном разрешении в размере 100 мкм. Если используются высокочувствительные методы МСП-МС (например, секторальные ПМС-МС), то могут быть достигнуты исключительно низкие пределы обнаружения. В исследовании о влиянии лимирования на Зн и Cd поглощениякукурузы 15, мы смогли сопоставить labile Cd в корневища кукурузы в незагрязненных почвы с ограничением обнаружения 38 пг см-2 cd на гель области. DGT, планарные оптоды и цымография опираются на диффузию целевого элемента из почвы в слой геля, который может быть использован для комбинированного применения этих методов для одновременного или последовательного изображения большого количества параметров, имеющих отношение к питательным веществам растений и поглощению загрязняющих веществ. Подробная информация об аналитических химических аспектах DGT изображений, о потенциале объединения DGT и других методов визуализации, а также о его применении всесторонне рассматривается в рефери34,35.
В этой статье мы описываем, как провести сорутный эксперимент изображения с использованием метода DGT на корнях наземных растений в ненасыщенной почве окружающей среды, в том числе выращивание растений, производство геля, гель применения, гель анализа и генерации изображений. Все шаги подробно проработаны, включая заметки о критических шагах и экспериментальные альтернативы.
Протокол соютой визуализации, представленный здесь, является универсальным методом визуализации и количественной оценки 2D питательных веществ и загрязняющих веществ в почве-растительной среде. Он уникален своей способностью генерировать суб-мм масштаба многофюкторных изображений половых растворимых видов на почве-корневом интерфейсе, превышая достижимое пространственное разрешение альтернативных методов измерения растворимых градиентов в корневойсфере существенно 4. Целевой подход DGT к отбору проб на месте в сочетании с высокочувствительным методом химического анализа, таким как LA-ICP-MS, облегчает детальное исследование динамики растворимого потока вокруг отдельных корней растений, выращенных в почве или аналогичных субстратах. Из-за процесса отбора проб на основе раковины полученные изображения отражают lability визуализированных растворов, и, следовательно, являются оценкой их растительнойдоступности 10. Хотя присущее методу измерение растворимых потоков имеет значительные преимущества, такие как интерпретируемость как доступные для растений питательные фракции, измерения потока гораздо менее прямолинейны для понимания, чем измерения концентрации морской воды. Стандартная геометрия выборки DGT в массовых применениях почвы (в частности, 0,8 мм толщиной диффузионных гелей, используемых в этой установке) позволяет сравнивать фактическую концентрацию поры, csoln, и в среднем по времени оценки концентрации морской воды навалом DGT измерения, cDGT, и для интерпретации этих параметров в отношении снабжения динамики растворимого вида. Тем не менее, такое сравнение не может быть сделано на основе изображения DGT приложения с очень тонкими слоями диффузии, так как производные значения cDGT нереально малы34. Таким образом, результаты визуализации DGT не всегда просты и быстры в интерпретации и часто не напрямую сопоставимы с более обычными измерениями концентрации морской воды.
При применении метода необходимо тщательно продумать несколько важных шагов, в основном связанных с заполнением и поливом контейнеров роста ризотрона. При заполнении почвы в ризотрон, очень важно, чтобы избежать уплотнения почвы слишком много, так как корни растений не могут проникнуть сильно уплотненной почве и рост корней будет ингибироваться. Мы наблюдали корни избегая сильно уплотненной почвы и растет вдоль внутренних краев контейнера роста ризотрона, где почва, как правило, менее уплотняется. В этом случае отдельные корни, расположенные в центре ризотронов, где гель DGT можно применять удобно, могут вообще не развиваться, эффективно подавляя успешное применение геля. В нашей лаборатории опыт показал, что плотность сухого грунта 1,0-1,4г см -3 позволяют беспрепятственно развитие корней. Кроме того, чрезмерное уплотнение почвы также является потенциальным источником артефактов, касающихся чувствительность чувствительных к редоксу элементов и биогеохимически связанных видов. По мере сокращения общего объема пор и сдвига диаметра пор в сторону более низких диаметров в высоко уплотненной почве имеется меньше заполненных воздухом пор большего диаметра, что может привести к редуктивным условиям на местном уровне. Следовательно, MnIII/IV– и FeIII– оксиды могут быть уменьшены, что приводит к увеличению Mn2 “и Fe2″ потоки. Растворение оксидов фе, которые являются важными местами сорбции, например, для фосфатов и микроэлементов, может освободить сорбированную и/или совместно осаждаемую такие виды и тем самым вызвать искусственно повышенные потоки биогеохимически связанных видов. Аналогичная проблема может возникнуть, если контейнеры роста поливать слишком много. Испарение через небольшую площадь поверхности почвы в верхней части контейнера роста является низким и почва может оставаться насыщенной водой в течение нескольких недель после посадки, которые также могут вызвать redox артефактов.
Другим важным соображением является химическая функциональность изготовленного геля связывания HR-DGT. Следуя протоколу, получаются тонкие гели с однородным распределением связывающих фаз. Если гели имеют области неоднородного распределения материала (например, отверстия в геле или агрегатах связывающих фаз), эти области необходимо удалить или, если они слишком обширны, протокол изготовления геля должен быть повторен. Если подготовлено правильно, гель должен быть в состоянии связать целевой раствор видов, которые рассеиваютсяв гель немедленно и количественно 27, который определяется анализ-специфической геля связывания потенциала. Хотя превышение емкости геля является менее проблематичным в незагрязненных почвах, его следует учитывать в загрязненных металлом почвах и солевой почве. Насыщение фаз связывания геля не только ухудшит количественную отбор проб, но и приведет к боковому рассеиванию растворов между связывающими фазами в геле, что приведет к бессрочной локализации мелкомасштабных растворимых флюсов. Таким образом, если в целевой почве ожидается очень большое количество половых питательных веществ/загрязняющих видов, следует про проводить предварительные испытания. Для оценки ожидаемых DGT нагрузок, объем почвы DGT поршневой выборки следуют гель elution и мокро-химическийанализ может быть применен 15,49. При необходимости время развертывания DGT может быть скорректировано, чтобы сократить время контакта с гелем и тем самым избежать насыщения гелем пороговых значений емкости. И наоборот, предварительные тесты также могут быть полезны для выявления требуемого времени контакта геля и/или чувствительности LA-ICP-MS, если ожидается очень низкая сольная нагрузка, которая может иметь важное значение для картирования солютов микроэлементов на естественных фоновыхуровнях почвы 15. Кроме того, правильное функционирование геля DGT должно быть проверено перед его экспериментальным применением с помощью контролируемой загрузки гелей при подготовке стандартов калибровки DGT LA-ICP-MS. Стандарт геля обеспечивает матричную нагрузку эталонного геля, которая может быть использована для оценки нагрузки образцов геля, определяемой LA-ICP-MS, в пределах ожидаемого диапазона. Если не удается получить сигнал, который отличается от газа и метод пустой фоновый шум, оператор должен убедиться, что лабораторные процедуры для анализа микроэлементов были реализованы и все этапы протокола были выполнены правильно. Иногда гель DGT случайно переворачивается после соляной выборки с открытой почвой, загруженной стороной, обращенной к стеклянной пластине, а не к лазерному лучу, что приводит к низкой интенсивности сигнала и ошибочно перевернутым функциям в окончательных изображениях потока раствора.
В ходе анализа LA-ICP-MS генерируется большое количество данных, что требует значительного времени для оценки. В нашей лаборатории мы используем скрипты оценки данных, адаптированные для нашего формата вывода целевых данных, используя стандартное программное обеспечение для электронных таблиц. После полуавтоматической сортировки и калибровки, построение изображений проводится с использованием инструментов анализа изображений с открытым исходным кодом (ImageJ, Fiji50). Такой подход позволяет полностью контролировать сортировку, оценку и представление данных, что необходимо, поскольку собранные данные соответствуют прямоугольным, а не квадратным пикселям, которые должны быть должным образом отображены на генерируемых соляных картах. Кроме того, при обработке данных следует тщательно избегать любой пиксельной интерполяции. Пиксельная интерполяция приводит к сглаживанию градиентов на химических изображениях, что приводит к смягчению часто круговых функций распределения элементов и, следовательно, является нежелательным изменением исходных данных. Пиксельная интерполяция является стандартной процедурой при повторном масштабировании и переформатировании операций во многих программных продуктах обработки изображений, но обычно может быть удалена.
В заключение, описанный метод является значительным достижением для понимания питательных веществ и динамики загрязняющих веществ в естественных почво-ризосферно-растительных системах. В дополнение к DGT-только приложения, метод может быть объединен с другими, диффузии наоснове методов визуализации, как планарныеоптоды3, 33,42,43,48,51 и zymography20,21,22,23,24, и могут быть разработаны для включения дополнительных элементов и параметров почвы.
The authors have nothing to disclose.
Это исследование было совместно профинансировано Австрийским научным фондом (FWF): P30085-N28 (Томас Прохаска) и Австрийским научным фондом (FWF) и Федеральной государством Нижняя Австрия: P27571-BBL (Якоб Сантнер).
(NH4)2S2O8 (ammonium persulfate; APS) | VWR | 21300.260 | ≥98.0%, analytical reagent |
2-(N-morpholino)-ethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M8250-100G | ≥99.5% |
Acrylamide solution | Sigma-Aldrich | A4058-100ML | 40%, for electrophoresis |
Analyte salts | n/a | n/a | Use water soluble analyte salts of analytical grade or higher |
Buechner funnel | VWR | 511-0065 | 13 cm plate diameter |
Chemical equilibrium modelling software | KTH Sweden | n/a | Visual MINTEQ |
Clamp | Local warehouse | n/a | |
Desktop publishing software | Adobe Inc. | n/a | InDesign CS6 |
DGT cross-linker | DGT Research Ltd | n/a | 2%, agarose derivative |
DGT piston sampler | DGT Research Ltd | n/a | 2 cm diameter exposure window |
Digital single-lens reflex (DSLR) camera | Canon Inc. | n/a | Canon EOS 1000D |
Dispersion device | IKA | 3737000 | Ultra-Turrax T10 Basic |
Double-sided adhesive tape | Tesa | 56171 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 34923 | Puriss. p.a., absolute, ≥99.8% |
Gel blotting paper | Whatman | 10426981 | Blotting Papers, Grade GB005, 20 × 20 cm, 1.5 mm thickness |
Gel drier | UniEquip | n/a | UNIGELDRYER 3545 |
High-pressure microwave system | Anton Paar | n/a | Multiwave 3000 |
HNO3 | VWR | 1.00456.2500P | 65%, ISO for analysis |
Horizontal shaker | GFL | 305 | |
HydroMed D4 | AdvanSource Biomaterials Corp. | n/a | Ether-based hydrophilic urethane |
ICP-MS software | Perkin Elmer | n/a | Syngistix |
Image analysis software | National Institutes of Health (NIH) | n/a | ImageJ Fiji, freely available at https://fiji.sc/ |
Knife-coating device | BYK | 5561 | Single Bar 6″, 0.5 mils |
LA software | Elemental Scientific Lasers | n/a | ActiveView |
LA system | Elemental Scientific Lasers | n/a | NWR193 |
Laminar flow bench | Telstar Laboratory Equipment B.V. | n/a | Class II biological safety cabinet |
Magnetic stirrer | IKA | 0003582400 | C-MAG MS 7 |
Moisture-retaining film | Bemis Company, Inc. | PM999 | Parafilm M, 4" x 250' |
N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281-50ML | BioReagent, suitable for electrophoresis, ~99% |
NaNO3 | Sigma-Aldrich | 229938-10G | 99.995% trace metals basis |
NaOH | Sigma-Aldrich | 1064980500 | Pellets for analysis |
Overhead shaker | GFL | 3040 | |
Perfluoroalkoxy alkane (PFA) vials | Savillex | 200-015-20 | 15 mL Standard Vial, Rounded Interior |
pH meter | Thermo Scientific | 13-644-928 | Orion 3-Star Benchtop pH Meter |
pH probe | Thermo Scientific | 8157BNUMD | Orion ROSS Ultra pH/ATC Triode |
Plastic cutter | DGT Research Ltd | n/a | Use empty cross-linker vials from DGT research Ltd |
Plastic tweezers | Semadeni | 602 | |
Plasticine | Local stationary shop | n/a | non-drying plastic modelling mass based on paraffin wax and bulking agents |
Polycarbonate membrane discs | Whatman | 110606 | Nuclepore Hydrophilic Membrane, 25 mm diameter, 0.2 µm pore size, 10 µm thickness |
Polycarbonate membrane sheet | Whatman | 113506 | Nuclepore Hydrophilic Membrane, 8 × 10 in, 0.2 µm pore size, 10 µm thickness |
Polyethersulfone membrane discs | Pall Corporation | 60172 | Supor 450 Membrane Disc Filters, 25 mm diameter, 0.45 µm pore size, 0.14 mm thickness |
Polyethersulfone membrane sheet | Pall Corporation | 60179 | Supor 450 Membrane Disc Filters, 293 mm diameter, 0.45 µm pore size, 0.14 mm thickness |
PTFE foil | Haberkorn | n/a | 50 µm thickness |
PTFE spacer | Haberkorn | n/a | Variable thicknesses available |
PTFE-coated razor blades | Personna GEM | 62-0178 | Stainless steel single edge blades (coated) |
PTFE-coated Tygon tubing | S-prep GmbH | SP8180 | 0.32 cm inner diameter |
Quadrupole ICP-MS | Perkin Elmer | N8150044 | NexION 2000B |
Quantitative filter paper, 454 | VWR | 516-0854 | Particle retention 12-15 µm |
Spreadsheet software | Microsoft Corporation | n/a | Microsoft Excel 2016 (v16.0) |
Stainless-steel cutter | Local locksmithery | n/a | 2.5 cm diameter |
Suspended particulate reagent-iminodiacetate (SPR-IDA) | Teledyne CETAC Technologies | n/a | 10 µm diameter polystyrene beads, 10 % (w/v) bead suspension |
Transistor-transistor logic (TTL) cable | n/a | n/a | Consult ICP-MS technician to identify a suitable TTL cable for a specific instrument |
Two-volume cell | Elemental Scientific Lasers | n/a | Two-volume cell 1 |
Vinyl electrical tape | 3M | n/a | Scotch Super 33+ |
Water purification system | Termo Electron LED GmbH | n/a | TKA-GenPure |
ZrOCl2 × 8H2O | Alfa Aesar | 86108.30 | 99.9 %, metals basis |