此协议提供了多个阴唇无机养分和污染物溶胶物种的亚毫米 2D 可视化工作流程,使用薄膜 (DGT) 中的扩散梯度与质谱成像相结合。详细描述了在陆地植物的岩石圈中对溶解物进行定量测绘的索卢特采样和高分辨率化学分析。
我们描述了一种二维(2D)可视化和量化阴唇分布的方法(即 逆向吸收)无机养分(如P、Fe、Mn)和污染物(如Cd、Pb)以低于毫米(约100微米)的空间分辨率在植物根部(”rhizosphere”)相邻的土壤中溶解物种。该方法结合了薄膜(DGT)技术中扩散梯度的沉基溶胶采样与激光消融感应耦合等离子质谱(LA-ICP-MS)的空间解化学分析。DGT 技术基于具有均匀分布分析器选择性结合相的薄水凝胶。可用绑定阶段的多样性允许在简单的凝胶制造程序后制备不同的 DGT 凝胶类型。对于 Rhizosphere 中的 DGT 凝胶部署,植物生长在平坦、透明的生长容器 (rhizotrons) 中,从而能够以最小的侵入性进入土壤生长的根系。在生长前阶段后,DGT 凝胶应用于某些感兴趣的区域,用于在 rhizospher 中进行原位溶胶采样。之后,使用 LA-ICP-MS 线扫描成像检索并准备随后对绑定溶胶进行化学分析。使用 13C 应用内部规范化,使用矩阵匹配凝胶标准进行外部校准,进一步允许 2D 溶质通量的量化。该方法在土壤植物环境中生成多元素溶质通量的定量、亚毫米比例二维图像的能力方面独树一帜,大大超过了测量日光圈中溶质梯度的其他方法的可实现空间分辨率。我们介绍了在陆地植物的岩石圈中成像多成离子和肛门溶质物种的方法的应用和评价,并强调了将这种方法与补充溶质成像技术相结合的可能性。
作物植物的营养获取是决定作物产量的关键因素。对作物有效吸收养分的过程进行了深入的研究,特别是通过土壤根系(rhizosphere)的植物根控制养分供应和养分内化的机制,因其在作物养分获取中的作用而得到认可。植物养分吸收的重要过程包括:向根部输送营养:溶解在土壤孔隙水中的物种与与固体土壤表面相连的物种之间的动态吸附平衡:微生物对营养物质的竞争;土壤有机物中所含养分的微生物矿化:和营养内化到根部症状。无机微量金属(oid)污染物的吸收在很大程度上由相同的机制控制。
根据养分和污染物的供应、植物需求和土壤中的扩散性,可以观察到岩石圈中的差异养分模式。对于内化率较高的强吸附元素(例如, P,Fe,Mn,Zn,As,Cd,Pb),与散装土壤相比,阴唇(即可逆吸附)元素部分的耗竭,耗竭区宽度通常≤1毫米,而对于更多的移动养分,如NO3-,耗竭区可以延伸至几厘米1。此外,当可用性超过工厂吸收率2、3时,还观察到 Al 和 Cd 等元素的积累。
鉴于 rhizosphere 过程在养分和污染物循环中的重要性,已开发出几种以高空间分辨率测量植物可用元素分数的技术。然而,测量小规模的腹腔溶胶分布已被证明是具有挑战性的,有几个原因。一个主要困难是在与活植物根相邻的固定位置对非常小(低 μL 范围)的土壤和/或孔水进行采样,以解决 rhizosphere 中陡峭的养分梯度。解决这个问题的方法之一是使用微吸杯提取孔隙水样品6。通过这种方法,A. Güttlein、A. Heim 和 E. Matzner7测量了奎尔库斯罗布尔L. 根附近的土壤孔水养分浓度,其空间分辨率为 +1 厘米。分析 μL 土壤或土壤溶液量的一个困难是,这些小样本量与除主要养分物种外的所有低浓度相结合,需要高度敏感的化学分析技术。
另一种系统,能够解决营养梯度在分辨率下降到〜0.5毫米,是种植根垫在土壤块的表面,与薄亲水膜层分离土壤从根8,9。在这种配置中,溶胶可以穿过膜,根可以从土壤中产生养分和污染物,而根渗出物可以扩散到土壤中。建立密集的根层后,可以对土壤块进行取样和切片,以获得土壤样本,以便随后提取元素部分。通过这种方式,可以分析在相对较大的区域(约100厘米2)平均的一维营养素和污染物梯度。
另一个挑战是获得实验室、植物可用元素部分的样本,因为大多数化学土壤提取技术的运作方式与植物获取养分和污染物的机制大相径庭。在许多土壤提取协议中,土壤与萃取溶液混合,目的是在溶解元素和冰激元素部分之间建立(伪)平衡。然而,植物不断内化养分,因此,往往逐渐耗尽了里佐圈的土壤。虽然均衡提取方案已被广泛采用作为土壤测试,因为它们很容易实施,提取的营养成分往往不代表植物可用的营养成分井10,11,12,13。不断耗尽被采样土壤养分的水槽方法已被建议为有利的方法,并可能更类似于潜在的养分吸收机制,模仿根吸收过程10,11,14,15。
除了上述方法外,还开发了能够测量分辨率为≤100μm的连续参数图的真人成像应用,用于特定元素和土壤(生物)化学参数5。自传可以用来成像元素分布在日光圈,只要有合适的放射性同位素16。平面光电图可可视化重要的土壤化学参数,如pH值和pO217、18、19,酶活性或蛋白质总分布可以使用荧光指示器成像技术(如土壤成像20、21、22、23和/或根部印迹方法24)进行映射。虽然酶成像和自传仅限于一次测量单个参数,但使用平面光电图进行 pH 和 pO2成像可以同时完成。更传统的根垫技术仅提供一维信息,而微吸盘提供点测量或低分辨率二维信息,但两种方法都允许多元素分析。最近,P.D. Ilhardt等人提出了一种利用激光诱导分解光谱(LIBS)绘制2D总多元素分布图的新方法,分辨率为+100μm的土壤根芯样品,通过仔细的样品准备保留了自然元素分布。
唯一能够以高空间分辨率对多种营养物质和污染物溶解物进行二维取样的技术是薄膜(DGT)技术中的扩散梯度,这是一种基于水槽的取样方法,可在嵌入在水凝胶层26、27层的结合材料上原位固定可移动的实验室微量金属(loid)物种。DGT作为测量沉积物和水域中腹腔溶解物的化学规格技术被引入,并很快被用于土壤28。它使亚毫米比例的多元素溶胶成像,这是最初在河流沉积物29中演示,并已进一步开发,以应用于植物里佐圈30,31,32,33。
对于 DGT 取样,在土壤块表面层生长的单个植物根上涂上一块大小约为 3 厘米 x 5 厘米的凝胶片,用亲水膜将凝胶与土壤分离。在接触期间,阴唇营养物质和/或污染物扩散到凝胶上,并立即被凝胶中加入的结合材料所束缚。通过这种方式,在采样过程中建立了浓度梯度,从而建立了对凝胶的连续净通量。取样后,可以使用分析化学技术去除和分析水凝胶,从而进行空间解析分析。为此目的,一项高度专业化且常用的技术是激光消融感应耦合等离子体质谱仪 (LA-ICP-MS)。在一些早期研究中,微粒子诱导的X射线发射(PIXE)也被使用29。DGT 采样与 LA-ICP-MS 分析相结合,可实现空间分辨率为 100μm 的多元素化学成像。如果采用高度敏感的 ICP-MS 技术(例如部门领域 ICP-MS),则可以达到极低的检测限制。在一项有关玉米15号对Zn和Cd吸收的影响的研究中,我们能够绘制出未受污染土壤中玉米里佐圈的阴唇CD,每个凝胶面积的检测限量为38 pgcm-2。DGT、平面光学和酶学依赖于目标元素从土壤扩散到凝胶层,这些凝胶层可用于这些方法的联合应用,以便同时或连续地成像与植物养分和污染物吸收相关的大量参数。关于DGT成像分析化学方面的详细信息,关于DGT和其他成像方法相结合的潜力,以及它的应用,在参考第34,35中进行了全面审查。
本文介绍了如何利用DGT技术对不饱和土壤环境中的陆生植物根部进行溶解成像实验,包括植物栽培、凝胶制造、凝胶应用、凝胶分析和图像生成。所有步骤都详细阐述,包括关于关键步骤和实验备选方案的说明。
此处介绍的溶质成像方案是一种多功能方法,可可视化和量化土壤植物环境中的二维养分和污染物通量。它具有独特的能力,能够产生亚毫米比例的多元素图像的腹腔溶质物种在土壤根界面,超过可实现的空间分辨率的替代方法测量溶质梯度在rhizosphere基本上4。DGT 的定点现场采样方法,结合 LA-ICP-MS 等高度敏感的化学分析方法,有助于详细研究土壤或类似基质中生长的单个植物根部周围的溶质通量动力学。由于基于水槽的取样过程,获得的图像反映了可视化溶解物的易感性,因此估计其植物可用性为10。虽然溶质通量的方法固有的测量具有相当大的优势,如可解释为植物可用的营养成分,但通量测量远不如孔水浓度测量更直接理解。散装土壤应用中的标准 DGT 采样几何形状(特别是该设置中使用的 0.8 毫米厚扩散凝胶)允许通过批量 DGT 测量cDGT和解释这些参数对溶质物种的再补给动力学进行比较实际孔隙水浓度、csoln和时间平均孔水浓度估计值。但是,这种比较不能基于具有非常薄扩散层的成像 DGT 应用程序进行,因为派生的cDGT值是不切实际的小34。因此,DGT成像结果并不总是简单和快速的解释,往往不能直接与更传统的孔隙水浓度测量相提并论。
在应用该方法时,需要仔细考虑一些关键步骤,主要涉及灌装和浇注 rhizotron 生长容器。在将土壤填入 rhizotron 时,避免过多压实土壤非常重要,因为植物根不能穿透强压实的土壤,根的生长将受到抑制。我们观察到根部避免强烈压实的土壤,沿着rhistron生长容器的内缘生长,那里的土壤通常不太紧凑。在这种情况下,位于rhigzotrons中心的单个根,其中DGT凝胶可以方便地应用,可能根本不开发,有效地抑制了成功的凝胶应用。在我们的实验室中,经验表明,1.0-1.4 gcm-3 的干燥土壤散装密度允许不受阻碍的根部发育。此外,过度的土壤压实也是有关氧化物敏感元素和生物地球化学相关物种溶解性的潜在人工来源。由于毛孔总体积减少,毛孔直径分布向高度压实土壤中的低直径转移,因此可用的气填充量较小,从而可能导致局部的还原条件。因此,MnIII/IV– 和 FeIII– 氧化物可能会减少,导致 Mn2+ 和 Fe2+ 通量增加。Fe-oxides的溶解是磷酸盐和微量营养素的重要吸附点,可以解放冰山和/或共同沉淀的物种,从而导致生物地球化学相关物种的人工增高通量。如果生长容器浇水过多,也可能会出现类似的问题。通过生长容器顶部的小土壤表面积蒸发量较低,土壤在种植后可能保持水饱和长达几个星期,这也可能导致重氧化人工制品。
另一个重要考虑因素是制造 HR-DGT 结合凝胶的化学功能。通过遵循协议,获得具有均匀分布的绑定相的薄凝胶。如果凝胶具有不均匀的材料分布区域(例如凝胶或结合相聚合的孔),则需要去除这些区域,或者,如果范围太广,则需要重复凝胶制造协议。如果准备正确,凝胶必须能够结合目标溶胶物种,立即和定量地扩散到凝胶27,这是由分析特异性凝胶结合能力决定的。虽然在未受污染的土壤中,超过凝胶容量的问题较小,但在金属污染土壤和盐碱土壤环境中应予以考虑。凝胶结合相的饱和不仅会损害定量溶胶采样,而且还会导致凝胶中结合相之间的溶解物横向扩散,导致小规模溶胶通量特征的无限期本地化。因此,如果目标土壤环境中预期有大量阴唇养分/污染物物种,则应进行初步测试。对于估计预期的DGT负荷,散装土壤DGT活塞采样,其次是凝胶elution和湿化学分析可以应用15,49。如有必要,可调整 DGT 部署时间以减少凝胶接触时间,从而避免凝胶饱和度超过容量阈值。相反,初步测试也有助于确定所需的凝胶接触时间和/或LA-ICP-MS灵敏度,如果非常低的溶质负荷预期,这可能是重要的映射微量元素溶解物在自然土壤背景水平15。此外,在制定DGT LA-ICP-MS校准标准时,应通过对凝胶的可控加载进行实验应用前验证正确的DGT凝胶功能。凝胶标准提供矩阵匹配的参考凝胶分析加载,可用于评估 LA-ICP-MS 确定的样品凝胶装载是否在预期范围内。如果无法获得与气体和方法空白背景噪声不同的信号,操作员必须确保实施跟踪元素分析的实验室程序,并正确执行所有协议步骤。有时,DGT 凝胶在用土壤暴露的、加载的侧面朝向玻璃板而不是激光束进行溶胶采样后意外翻转,导致最终溶胶通量图像中信号强度低且错误地翻转特征。
在洛杉矶-ICP-MS分析期间,生成了大量数据,这需要相当长的时间进行评估。在我们的实验室中,我们使用针对目标数据输出格式定制的内部数据评估脚本,使用标准电子表格软件。半自动排序和校准后,使用开源、开放访问图像分析工具(ImageJ,斐济50)进行图像绘图。这种方法允许完全控制数据排序、评估和演示,这一点至关重要,因为收集的数据对应于矩形,而不是二次像素,这需要正确地显示在生成的 solute 地图中。此外,在数据处理过程中,应小心避免任何像素插点。像素插点导致化学图像的梯度平滑,导致软化,通常是圆形元素分布特征,因此是原始数据的不良变化。像素插管是许多图像处理软件产品重新缩放和重新格式化操作的标准程序,但通常可以取消选择。
总之,上述方法是了解天然土壤-里佐圈-植物系统中的养分和污染物动力学的重大进展。除了 DGT 专用应用外,该方法还可以与其他基于扩散的成像技术(如平面光学 3、33、42、43、48、51 和 zym 光谱20、21、22、23、24)相结合,并可进一步开发以包括附加元素和土壤参数。
The authors have nothing to disclose.
这项研究由奥地利科学基金(FWF):P30085-N28(托马斯·普罗哈斯卡)和奥地利科学基金(FWF)以及下奥地利联邦州共同资助:P27571-BBL(雅科布·桑特纳)。
(NH4)2S2O8 (ammonium persulfate; APS) | VWR | 21300.260 | ≥98.0%, analytical reagent |
2-(N-morpholino)-ethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M8250-100G | ≥99.5% |
Acrylamide solution | Sigma-Aldrich | A4058-100ML | 40%, for electrophoresis |
Analyte salts | n/a | n/a | Use water soluble analyte salts of analytical grade or higher |
Buechner funnel | VWR | 511-0065 | 13 cm plate diameter |
Chemical equilibrium modelling software | KTH Sweden | n/a | Visual MINTEQ |
Clamp | Local warehouse | n/a | |
Desktop publishing software | Adobe Inc. | n/a | InDesign CS6 |
DGT cross-linker | DGT Research Ltd | n/a | 2%, agarose derivative |
DGT piston sampler | DGT Research Ltd | n/a | 2 cm diameter exposure window |
Digital single-lens reflex (DSLR) camera | Canon Inc. | n/a | Canon EOS 1000D |
Dispersion device | IKA | 3737000 | Ultra-Turrax T10 Basic |
Double-sided adhesive tape | Tesa | 56171 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 34923 | Puriss. p.a., absolute, ≥99.8% |
Gel blotting paper | Whatman | 10426981 | Blotting Papers, Grade GB005, 20 × 20 cm, 1.5 mm thickness |
Gel drier | UniEquip | n/a | UNIGELDRYER 3545 |
High-pressure microwave system | Anton Paar | n/a | Multiwave 3000 |
HNO3 | VWR | 1.00456.2500P | 65%, ISO for analysis |
Horizontal shaker | GFL | 305 | |
HydroMed D4 | AdvanSource Biomaterials Corp. | n/a | Ether-based hydrophilic urethane |
ICP-MS software | Perkin Elmer | n/a | Syngistix |
Image analysis software | National Institutes of Health (NIH) | n/a | ImageJ Fiji, freely available at https://fiji.sc/ |
Knife-coating device | BYK | 5561 | Single Bar 6″, 0.5 mils |
LA software | Elemental Scientific Lasers | n/a | ActiveView |
LA system | Elemental Scientific Lasers | n/a | NWR193 |
Laminar flow bench | Telstar Laboratory Equipment B.V. | n/a | Class II biological safety cabinet |
Magnetic stirrer | IKA | 0003582400 | C-MAG MS 7 |
Moisture-retaining film | Bemis Company, Inc. | PM999 | Parafilm M, 4" x 250' |
N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281-50ML | BioReagent, suitable for electrophoresis, ~99% |
NaNO3 | Sigma-Aldrich | 229938-10G | 99.995% trace metals basis |
NaOH | Sigma-Aldrich | 1064980500 | Pellets for analysis |
Overhead shaker | GFL | 3040 | |
Perfluoroalkoxy alkane (PFA) vials | Savillex | 200-015-20 | 15 mL Standard Vial, Rounded Interior |
pH meter | Thermo Scientific | 13-644-928 | Orion 3-Star Benchtop pH Meter |
pH probe | Thermo Scientific | 8157BNUMD | Orion ROSS Ultra pH/ATC Triode |
Plastic cutter | DGT Research Ltd | n/a | Use empty cross-linker vials from DGT research Ltd |
Plastic tweezers | Semadeni | 602 | |
Plasticine | Local stationary shop | n/a | non-drying plastic modelling mass based on paraffin wax and bulking agents |
Polycarbonate membrane discs | Whatman | 110606 | Nuclepore Hydrophilic Membrane, 25 mm diameter, 0.2 µm pore size, 10 µm thickness |
Polycarbonate membrane sheet | Whatman | 113506 | Nuclepore Hydrophilic Membrane, 8 × 10 in, 0.2 µm pore size, 10 µm thickness |
Polyethersulfone membrane discs | Pall Corporation | 60172 | Supor 450 Membrane Disc Filters, 25 mm diameter, 0.45 µm pore size, 0.14 mm thickness |
Polyethersulfone membrane sheet | Pall Corporation | 60179 | Supor 450 Membrane Disc Filters, 293 mm diameter, 0.45 µm pore size, 0.14 mm thickness |
PTFE foil | Haberkorn | n/a | 50 µm thickness |
PTFE spacer | Haberkorn | n/a | Variable thicknesses available |
PTFE-coated razor blades | Personna GEM | 62-0178 | Stainless steel single edge blades (coated) |
PTFE-coated Tygon tubing | S-prep GmbH | SP8180 | 0.32 cm inner diameter |
Quadrupole ICP-MS | Perkin Elmer | N8150044 | NexION 2000B |
Quantitative filter paper, 454 | VWR | 516-0854 | Particle retention 12-15 µm |
Spreadsheet software | Microsoft Corporation | n/a | Microsoft Excel 2016 (v16.0) |
Stainless-steel cutter | Local locksmithery | n/a | 2.5 cm diameter |
Suspended particulate reagent-iminodiacetate (SPR-IDA) | Teledyne CETAC Technologies | n/a | 10 µm diameter polystyrene beads, 10 % (w/v) bead suspension |
Transistor-transistor logic (TTL) cable | n/a | n/a | Consult ICP-MS technician to identify a suitable TTL cable for a specific instrument |
Two-volume cell | Elemental Scientific Lasers | n/a | Two-volume cell 1 |
Vinyl electrical tape | 3M | n/a | Scotch Super 33+ |
Water purification system | Termo Electron LED GmbH | n/a | TKA-GenPure |
ZrOCl2 × 8H2O | Alfa Aesar | 86108.30 | 99.9 %, metals basis |