Внутриопухоловная гетерогенность является неотъемлемой чертой опухолей, в том числе и глиом. Мы разработали простой и эффективный протокол, который использует комбинацию буферов и градиентного центрифугирования для выделения одиночных ядер из свежезамороженных тканей глиомы для исследований секвенирования одноядерной РНК и ATAC.
Взрослые диффузные глиомы проявляют меж- и внутриопухоляистую гетерогенность. До недавнего времени большинство крупномасштабных усилий по молекулярному профилированию были сосредоточены на объемных подходах, которые привели к молекулярной классификации опухолей головного мозга. За последние пять лет подходы к секвенированию одиночных клеток выявили несколько важных особенностей глиом. В большинстве этих исследований использовались свежие образцы опухолей головного мозга для выделения отдельных клеток с использованием проточной цитометрии или методов разделения на основе антител. В дальнейшем использование свежезамороженных образцов тканей из биобанков обеспечит большую гибкость для одноклеточных применений. Кроме того, по мере продвижения одноклеточного поля следующей задачей будет генерация мультиомических данных либо из одной клетки, либо из одного образца препарата, чтобы лучше разгадать сложность опухоли. Поэтому простые и гибкие протоколы, которые позволяют генерацию данных для различных методов, таких как секвенирование одноядерной РНК (snRNA-seq) и анализ одного ядра для транспозазно-доступного хроматина с высокопроизводительный секвенированием (snATAC-seq), будут важны для этой области.
Последние достижения в области одноклеточных клеток в сочетании с доступными микрофлюидными инструментами, такими как платформа 10x genomics, облегчили применение одной клетки в исследовательских лабораториях. Для изучения гетерогенности опухоли головного мозга мы разработали расширенный протокол выделения одиночных ядер из свежезамороженных глиом. Этот протокол объединяет существующие одноклеточные протоколы и сочетает в себе этап гомогенизации, за которым следует фильтрация и буферное опосредованное градиентное центрифугирование. Полученные образцы представляют собой чистые суспензии одиночных ядер, которые могут быть использованы для генерации экспрессии гена одного ядра и данных о доступности хроматина из одного и того же препарата ядер.
Диффузные глиомы более низкой степени (LGG), наиболее распространенная первичная опухоль головного мозга у взрослых, являются инфильтративными новообразованиями, которые часто возникают в полушарии головного мозга. LGG проявляют как меж-, так и внутриопухоловную гетерогенность, которая обусловлена не только опухолевой популяцией, но и незлокачественными клетками, причудливо участвующими в развитии и прогрессировании опухоли1,2,3,4,5.
За последнее десятилетие произошла лавина геномных данных, собранных в области глиом. Эти данные в основном поступают из объемных исследований секвенирования опухолей и внесли огромный вклад в молекулярную характеристику и текущую классификацию опухолей головного мозга5,6,7,8,9,10,11. Однако, несмотря на то, что эти исследования выявили широкий молекулярный ландшафт, связанный с глиомами, все еще существует разочаровывающий недостаток прогресса в отношении терапевтического вмешательства. Одним из препятствий для резистентности к лечению опухолей головного мозга является внутриопухолевая гетерогенность. Чтобы решить эту проблему, различные исследования были сосредоточены на геномной, транскриптомной, протеомной и эпигенетической гетерогенности, присутствующей в опухоли на уровне одной клетки12,13,14,15,16,17.
Хотя за последние пару лет в области одиночных клеток были достигнуты замечательные технологические достижения, одним из основных ограничивающих факторов является наличие свежих образцов, необходимых для изоляции клеток и проведения этих экспериментов. Чтобы преодолеть это ограничение, было несколько успешных попыток выполнения анализов, таких как snRNA-seq и snATAC-seq из замороженных тканей, с использованием ядер, а не клеток18,19. Большинство из этих методов основаны либо на флуоресцентной активации сортировки клеток (FACS), либо на стратегиях фильтрации. Как одноклеточные, так и одноядерные подходы имеют свои сильные и слабые стороны. Одноклеточные подходы поддерживают митохондриальные транскрипты, которые, хотя и могут быть информативными, также могут уменьшить охват транскриптома из-за их высокого изобилия. Подходы к изоляции одиночных ядер устраняют высокий процент митохондриальной фракции, тем самым позволяя более глубоко охватить ядерные транскрипты20.
Существуют различные коммерчески доступные платформы, которые использовались в последние годы для анализа данных геномики одиночных клеток, включая RNA-seq и ATAC-seq. Одной из наиболее известных платформ является 10-кратная платформа Genomics Chromium для экспрессии одноклеточных генов и профилирования одноклеточных ATAC. Поскольку платформа работает с помощью микрофлюидных камер, любой мусор или агрегаты могут засорить систему, что приведет к потере данных, реагентов и ценных клинических образцов. Поэтому успех одноклеточных исследований во многом зависит от точной изоляции одиночных клеток/ядер.
Протокол, который мы продемонстрируем здесь, представляет собой слегка модифицированную комбинацию протоколов DroNc-seq и Omni-ATAC-seq и использует аналогичный подход к недавним исследованиям, которые используют snRNA-seq для понимания неврологических расстройств и типов нейрональных клеток в человеческом мозге18,19,21,22,23,24. Протокол использует комбинацию ферментативной/механической диссоциации замороженных образцов с последующей фильтрацией и градиентным центрифугированием и позволяет быстро и точно выделять одиночные ядра из свежезамороженных тканей глиомы. Мы успешно использовали этот протокол для генерации данных snRNA-seq и snATAC-seq из одного и того же препарата ядер из образцов опухолей головного мозга.
Область внутриопухолевой гетерогенности находится на захватывающей стадии, когда разрабатываются новые анализы и платформы, чтобы бросить вызов и расширить существующие знания. Внутриопухоловная гетерогенность является решающим фактором, который способствует прогрессированию заб…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Открытую лабораторию с одной клеткой (scOpenLab) в Немецком онкологическом центре (DKFZ) за полезные обсуждения. Это исследование было поддержано немецкой онкологической помощью, грантом программы Max-Eder Под номером 70111964 (S.T.).
2-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
CaCl2 | Sigma | 21115-100ML | |
Dounce Homogenizer | Active motif | 40401 | |
EDTA (0.5 M) | Thermo Scientific | R1021 | |
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Corning | 352235 | |
Iodixanol (aka Optiprep) | Stem cell technologies | 07820 | |
MACs Smart Strainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
MACS SmartStrainers (100 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-463 | |
Mg(Ac)2 | Sigma | 63052-100ML | |
NP-40 | Abcam | ab142227 | |
Nuclei Isolation Kit: Nuclei EZ Prep | Sigma | NUC101-1KT | |
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
Pre-Separation Filters (20 µm) | Miltenyi Biotec | 130-101-812 | |
Safe lock tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
Safe lock tubes 2.0 mL | Eppendorf | 0030120094 | |
Single Cell ATAC | 10x Genomics | ||
Single Cell Gene Expression | 10x Genomics | ||
Sucrose | Sigma | S0389 | |
Wide Bore pipette tips (1000 µL) | Themo Fisher Scientific | 2079GPK | |
Wide Bore pipette tips (200 µL) | Themo Fisher Scientific | 2069GPK |