التغايرية داخل الورم هي سمة متأصلة في الأورام، بما في ذلك الأورام الدبقية. لقد طورنا بروتوكولا بسيطا وفعالا يستخدم مزيجا من المخازن المؤقتة والطرد المركزي المتدرجة لعزل نواة واحدة عن أنسجة الورم الدبقي المجمدة الطازجة لدراسات تسلسل نواة واحدة من الحمض النووي الريبي و ATAC.
تظهر الأورام الدبقية المنتشرة للبالغين عدم تجانس بين الورم وداخله. حتى وقت قريب، ركزت غالبية جهود التنميط الجزيئي على نطاق واسع على النهج السائبة التي أدت إلى التصنيف الجزيئي لأورام الدماغ. على مدى السنوات الخمس الماضية، أبرزت نهج تسلسل الخلايا المفردة العديد من السمات الهامة للأورام الدبقية. وقد استخدمت غالبية هذه الدراسات عينات جديدة من ورم الدماغ لعزل الخلايا المفردة باستخدام قياس التدفق الخلوي أو طرق الفصل القائمة على الأجسام المضادة. وللمضي قدما، فإن استخدام عينات الأنسجة المجمدة الطازجة من البنوك الحيوية سيوفر مرونة أكبر لتطبيقات الخلايا الواحدة. وعلاوة على ذلك، مع تقدم حقل الخلية الواحدة، سيكون التحدي التالي هو توليد بيانات متعددة الوميست من خلية واحدة أو نفس إعداد العينة لكشف تعقيد الورم بشكل أفضل. لذلك، فإن البروتوكولات البسيطة والمرنة التي تسمح بتوليث البيانات لطرق مختلفة مثل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة (snRNA-seq) والنواة الوحيدة Assay ل Chromatin التي يمكن الوصول إليها بواسطة Transposase مع تسلسل عالي الإنتاجية (snATAC-seq) ستكون مهمة لهذا المجال.
وقد سهلت التطورات الأخيرة في مجال الخلية الواحدة إلى جانب الأدوات الدقيقة الفلورية التي يمكن الوصول إليها مثل منصة الجينوم 10x تطبيقات الخلايا المفردة في مختبرات البحوث. لدراسة عدم تجانس ورم الدماغ، وضعنا بروتوكولا معززا لعزل نواة واحدة من الأورام الدبقية المجمدة الطازجة. يدمج هذا البروتوكول بروتوكولات الخلية المفردة الموجودة ويجمع بين خطوة التجانس متبوعة بالتنقية والطرد المركزي المتدرجة الوسيطة المخزن المؤقت. العينات الناتجة هي تعليق نواة واحدة نقية التي يمكن استخدامها لتوليد التعبير الجيني نواة واحدة وبيانات الوصول الكروماتين من إعداد النوى نفسه.
الأورام الدبقية المنتشرة من الدرجة الأدنى (LGG)، وهي ورم الدماغ الأساسي الأكثر شيوعا لدى البالغين، هي الأورام المتسللة التي تنشأ في كثير من الأحيان في نصف الكرة الدماغي. LGGs تظهر كل من التغايرية بين وداخل الورم، والتي ليست مدفوعة فقط من قبل السكان الورم ولكن أيضا من قبل الخلايا غير الخبيثة تشارك بشكل معقد في تطور الورم والتقدم1،2،3،4،5.
على مدى العقد الماضي، كان هناك سيل من البيانات الجينومية التي تم جمعها في مجال الأورام الدبقية. هذه البيانات تأتي أساسا من الدراسات تسلسل الورم السائبة وساهمت بشكل كبير في التوصيف الجزيئي، والتصنيف الحالي لأورام الدماغ5،6،7،8،9،10،11. ومع ذلك ، على الرغم من أن هذه الدراسات كشفت عن المشهد الجزيئي الواسع المرتبط بالأورام الدبقية ، لا يزال هناك نقص مخيب للآمال في التقدم فيما يتعلق بالتدخل العلاجي. واحدة من العقبات التي تحول دون مقاومة العلاج في أورام الدماغ هو عدم التجانس داخل الورم. لمعالجة هذه المسألة، وقد تم التركيز على دراسات مختلفة الجينوم، transcriptomic، proteomic، والتغايرية اللاجينية موجودة داخل ورم في مستوى خلية واحدة12،13،14،15،16،17.
على الرغم من أن هناك تقدما تكنولوجيا ملحوظا في مجال الخلية الواحدة على مدى العامين الماضيين، واحدة من العوامل الرئيسية المقيدة هو توافر العينات الطازجة اللازمة لعزل الخلايا وإجراء هذه التجارب. للتغلب على هذا القيد، كانت هناك عدة محاولات ناجحة في إجراء المقايسات، مثل snRNA-seq و snATAC-seq من الأنسجة المجمدة، وذلك باستخدام النوى بدلا من الخلايا18،19. وتعتمد غالبية هذه الأساليب إما على فرز الخلايا المنشطة بالفلور (FACS) أو استراتيجيات الترشيح. كل من خلية واحدة ونهج نواة واحدة لها نقاط قوتها وعيوبها. نهج خلية واحدة الحفاظ على النصوص الميتوكوندريا، والتي على الرغم من أنها قد تكون مفيدة، يمكن أيضا أن تقلل من تغطية النسخ بسبب وفرة عالية. نهج عزل نواة واحدة القضاء على نسبة عالية من كسر الميتوكوندريا، مما يسمح بتغطية أكثر عمقا من النصوص النووية20.
هناك العديد من المنصات المتاحة تجاريا التي تم استخدامها على مدى السنوات الأخيرة لتقصي بيانات الجينوم خلية واحدة، بما في ذلك الحمض النووي الريبي-seq و ATAC-seq. واحدة من أبرز المنصات هي منصة الكروم الجينوم 10x للتعبير الجيني خلية واحدة والخلية الواحدة ATAC التنميط. كما تعمل المنصة بمساعدة غرف microfluidic، يمكن لأي حطام أو مجاميع تسد النظام مما يؤدي إلى فقدان البيانات والكواشف والعينات السريرية القيمة. لذلك ، يعتمد نجاح دراسات الخلايا المفردة إلى حد كبير على العزل الدقيق للخلايا / النوى المفردة.
البروتوكول الذي سنوضحه هنا هو مزيج معدل قليلا من بروتوكولات DroNc-seq و Omni-ATAC-seq ، ويستخدم نهجا مماثلا للدراسات الحديثة التي تستخدم snRNA-seq لفهم الاضطرابات العصبية وأنواعالخلايا العصبية في الدماغ البشري18و19و21و22و23و24. يستخدم البروتوكول مزيجا من الانزيمية / التفكك الميكانيكي للعينات المجمدة تليها الترشيح والطرد المركزي التدرج ويسمح لعزل سريع ودقيق من نواة واحدة من أنسجة الورم الدبقي المجمدة الطازجة. لقد استخدمنا بنجاح هذا البروتوكول لتوليد بيانات snRNA-seq و snATAC-seq من نفس إعداد النوى من عينات ورم الدماغ.
مجال التغاير داخل الورم هو في مرحلة مثيرة، مع المقايسات الجديدة والمنصات التي يجري تطويرها لتحدي وتوسيع المعرفة القائمة. التغاير داخل الورم هو عامل حاسم يساهم في تطور المرض ومقاومة طرائق العلاج الحالية في الأورام الدبقية28. وقد ركزت الدراسات الحديثة على أورام الدماغ على هذا ?…
The authors have nothing to disclose.
نشكر المختبر المفتوح للخلية الواحدة (scOpenLab) في المركز الألماني للسرطان (DKFZ) على المناقشات المفيدة. تم دعم هذا البحث من قبل المعونة الألمانية للسرطان، ماكس إيدر برنامج منحة رقم 70111964 (S.T.).
2-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
CaCl2 | Sigma | 21115-100ML | |
Dounce Homogenizer | Active motif | 40401 | |
EDTA (0.5 M) | Thermo Scientific | R1021 | |
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Corning | 352235 | |
Iodixanol (aka Optiprep) | Stem cell technologies | 07820 | |
MACs Smart Strainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
MACS SmartStrainers (100 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-463 | |
Mg(Ac)2 | Sigma | 63052-100ML | |
NP-40 | Abcam | ab142227 | |
Nuclei Isolation Kit: Nuclei EZ Prep | Sigma | NUC101-1KT | |
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
Pre-Separation Filters (20 µm) | Miltenyi Biotec | 130-101-812 | |
Safe lock tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
Safe lock tubes 2.0 mL | Eppendorf | 0030120094 | |
Single Cell ATAC | 10x Genomics | ||
Single Cell Gene Expression | 10x Genomics | ||
Sucrose | Sigma | S0389 | |
Wide Bore pipette tips (1000 µL) | Themo Fisher Scientific | 2079GPK | |
Wide Bore pipette tips (200 µL) | Themo Fisher Scientific | 2069GPK |