המאמר מתאר את הכמת של 1) את גודל ומספר של הידעיות מיקוד ו 2) אינדקס צורת תא ואת ההתפלגות שלה מתוך תמונות קונפוקלית וקד של המונאולאיירס הקונאולית של תאים MCF7.
השיטות המוצגות כאן מכמת כמה פרמטרים של תא מדומה מונואולאן מדומה מספר תמונות ויטראז ‘ מרובים: הדבקה למצע כפונקציה של מספר וגודל של מיקוד מוקד, וצורה תא, מאופיין על ידי מדד צורת התא ומתארי צורה אחרים. הידקויות מיקוד היו מדמיינו על ידי כתמים פקעבלין וגבולות תא התא סומנו על ידי הצומת פלקוטין ו actin. השיטות לתרבית תאים וכתמים היו סטנדרטיים; תמונות מייצגות מטוסי מוקד יחידים; ניתוח תמונה בוצעה באמצעות תוכנת עיבוד תמונה זמינה לציבור. הפרוטוקולים המוצגים משמשים כדי לכמת את מספר וגודל של הידקויות מיקוד ואת ההבדלים בפיזור הצורה התא ב monolayers, אבל הם יכולים להיות מחדש עבור כימות של גודל וצורה של כל מבנה הסלולר ברורים אחרים, כי יכול להיות מוכתם (למשל, המיטוa או גרעיני). הערכת פרמטרים אלה חשובה באפיון הכוחות הדינמיים בשכבת התא החסיד, כולל הדבקה בתאים וכיוונון actomyosin המשפיע על צורת התא.
תאי אפיתל monolayers לפעול כקולקטיב שבו תא תא ותא הדבקה, כמו גם כוחות ומתחים והמתיחות מייצגים פרמטרים חשובים האיזון הנכון שלהם תורמת השלמות הכוללת של היחידה1,2,3. לפיכך, הערכת פרמטרים אלה מייצגת דרך ליצירת המצב הנוכחי של שכבת התא.
שתי השיטות המתוארות כאן מייצגות ניתוח דו מימדי של המונאולאיירס הקונקולני של חסיד, תאי אפיתל (במקרה זה MCF7 סרטן השד קו התאים). הניתוח מבוצע באמצעות תמונות מיקוד (Z-פרוסות בודדות) מאזורים שונים על ציר Z; אזור בסיס ליד מצע למדידות מיקוד (FA) ולאזור אפיפיורי למדידות בצורת תא. השיטות המוצגות פשוטות יחסית ודורשות טכניקות סטנדרטיות של מעבדה ותוכנות קוד פתוח. מיקרוסקופ confocal וקד מספיק עבור פרוטוקול זה, כך שניתן לבצע מבלי להעסיק TIRF מיוחדים יותר (כולל השתקפות פנימית השתקפויות פלואורסצנטית) מיקרוסקופ. לפיכך, ניתן ליישם את הפרוטוקול במסגרת מעבדה סטנדרטית יחסית. למרות שרמת הדיוק של השיטות מוגבלת, הם יכולים להבחין בין הבדלים בסיסיים בצורה מוקד ובצורת תא.
שתי השיטות המתוארות כאן כוללות את ההליכים הניסיוניים הסטנדרטיים כגון כגון תא, כתמים, דימות ממוקד וניתוח תמונה שבוצעו באמצעות ImageJ. עם זאת, ניתן להשתמש בכל תוכנה לעיבוד תמונה עם הפונקציות המתאימות. השיטות שהוצגו יכול לעקוב ולהשוות שינויים שנגרמו על ידי טיפול תרופתי או שינוי גנטי מינימלי. השגת ערכים מסוימים אינה מומלצת, בשל הדיוק המוגבל של שיטות אלה. שתי פקודות מאקרו אוטומטיות נכללו, כדי להקל על המדידות של תמונות רבות.
תא תא ותא הדבקה של תא מהווים תכונות הטבועה של התאים אפיתל לשחק את התפקיד הקריטי ברקמות מורפולגנזה ו embriogenesis. ברקמות למבוגרים את הרגולציה הנכונה של תכונות מכניות של שכבת התא היא חיונית לשמירה על הומאוסטזיס ומניעת תגובות פתולוגיים כמו התקדמות הגידול גרורות. הגודל והמספר של הידקויות מיקוד ת?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכת על ידי המרכז הלאומי למדע הפולני תחת מענק מס ‘ 2014/14/M/NZ1/00437.
Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A32740 | goat anti-rabbit, 1:500 |
Ammonium chloride | Sigma | A9434 | |
BSA | BioShop | ALB001.500 | |
Collagen from calf skin | Sigma | C9791-10MG | |
DAPI | Sigma | D9542 | 1:10000 (stock 1 mg/mL in H2O), nucleic acid staining |
DMEM + GlutaMAX, 1 g/L D-Glucose, Pyruvate | ThermoFisher Scientific | 21885-025 | |
FBS | ThermoFisher Scientific | 10270-136 | |
Junction plakoglobin | Cell Signaling | 2309S | rabbit, 1:400 |
Laminar-flow cabinet class 2 | Alpina | standard equipment | |
MCF7-basedHAX1KD cell line | Cell line established in the National Institute of Oncology, Warsaw, described in Balcerak et al., 2019 | MCF7 cell line withHAX1knockdown | |
MCF7 cell line (CONTROL) | ATCC | ATCC HTB-22 | epithelial, adherent breast cancer cell line |
Olympus CK2 light microscope | Olympus | ||
Paxillin | Abcam | ab32084 | rabbit, 1:250, Y113 |
PBS | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
Phalloidin-TRITC conjugate | Sigma | P1951 | 1:400 (stock 5 mg/mL in DMSO), actin labeling |
PTX | Sigma | T7402-1MG | |
TBST – NaCl | Sigma | S9888 | |
TBST – Trizma base | Sigma | T1503 | |
Triton X-100 | Sigma | 9002-93-11 | |
Zeiss LSM800 Confocal microscope | Zeiss |