MCF7细胞单层中细胞基质粘附面积和细胞形状分布的定量
Summary
本文描述了1）焦点粘附的大小和数量，2）细胞形状指数及其分布从MCF7细胞的汇合单层共聚焦图像。
Abstract
此处介绍的方法从多个适当染色的共聚焦图像中量化了汇合粘附细胞单层之间的一些参数：粘附到基底，作为焦粘附数和大小的函数，以及以细胞形状索引和其他形状描述符为特征的细胞形状。焦粘附物通过paxillin染色和细胞边界以结球蛋白和行动素为标志。细胞培养和染色的方法是标准的;图像代表单个焦点平面;使用公开提供的图像处理软件进行图像分析。提出的协议用于量化焦点粘附的数量和大小以及单层中细胞形状分布的差异，但它们可以重新用于量化任何其他可染色的不同细胞结构（例如线粒体或核）的大小和形状。评估这些参数对于粘附细胞层中动态力的表征非常重要，包括影响细胞形状的细胞粘附和运动素收缩性。
Introduction
上皮细胞单层作为一个整体，其中细胞和细胞基板粘附以及收缩力和张力代表重要的参数,，其适当的平衡有助于单元1，2，3,2的整体完整性。因此，评估这些参数是建立细胞层的当前状态的一种方式。
此处描述的两种方法表示对粘附的上皮细胞（本例中为 MCF7 乳腺癌细胞系）的汇合单层进行二维分析。使用 Z 轴上不同区域的共和图像（单个 Z 切片）执行分析;基座附近的基底区域，用于焦粘附 （FA） 测量，用于细胞形状测量的平面区域。提出的方法相对简单，需要标准的实验室技术和开源软件。共体显微镜足以满足此协议，因此无需采用更专业的 TIRF（总内部反射荧光）显微镜即可执行。因此，该议定书可以在相对标准的实验室环境中实施。虽然方法的准确性有限，但它们可以区分焦粘附和细胞形状的基本差异。
此处描述的两种方法都包括使用 ImageJ 执行的标准实验程序，如细胞培养、免疫污染、共体成像和图像分析。但是，可以使用任何具有适当功能的图像处理软件。提出的方法可以跟踪和比较药理治疗或最小的基因改造带来的变化。由于这些方法的精度有限，不建议获取确定值。包括两个自动宏，以方便测量许多图像。
Protocol
1. 准备步骤 细胞播种，以获得汇合单层 播种前，用胶原蛋白 I（或选择的其他 ECM 组件）涂覆 4 孔室滑轨的孔。对于胶原蛋白 I 涂层，请遵循https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biofiles/collagen-product-protocols.html：浓度为 8 μg/cm2。 种子400，000细胞到一个井的4井室幻灯片。 染色前培养细胞24小时（或更长，取决于实验终点），在37°C的培养箱中，5%CO2?…
Representative Results
聚焦粘附分析HAX1基因的敲击先前被证明会影响焦点粘附6。细胞在胶原蛋白 I 涂层表面培养 48 小时。MCF7 控制细胞和 MCF7 细胞的图像与HAX1击倒（HAX1 KD） 从三个独立的实验染色的焦点粘附蛋白 paxillin 获得使用共聚焦显微镜 （图像从单焦平面/Z 切片从基础区域）.使用所述协议对来自每个细胞系中的大约 2，000-2，500 个细胞的 FA 进行量化。最小?…
Discussion
细胞细胞和细胞基质粘附构成上皮细胞的固有属性，在组织形态生成和痛苦中起关键作用。在成人组织中，适当调节细胞层的机械特性对于维持平衡和预防肿瘤进展和转移等病理反应至关重要。焦点粘附的大小和数量取决于细胞基质粘附的强度，而细胞形状取决于收缩力，并且与细胞-细胞接触的状态有关。
在这里，我们描述了两个简单的定量分析方法，即由免疫荧光染色的?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
波兰国家科学中心根据第2014/14/M/NZ1/00437号赠款支持了这项工作。
Materials
| Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A32740 | goat anti-rabbit, 1:500 |
| Ammonium chloride | Sigma | A9434 | |
| BSA | BioShop | ALB001.500 | |
| Collagen from calf skin | Sigma | C9791-10MG | |
| DAPI | Sigma | D9542 | 1:10000 (stock 1 mg/mL in H2O), nucleic acid staining |
| DMEM + GlutaMAX, 1 g/L D-Glucose, Pyruvate | ThermoFisher Scientific | 21885-025 | |
| FBS | ThermoFisher Scientific | 10270-136 | |
| Junction plakoglobin | Cell Signaling | 2309S | rabbit, 1:400 |
| Laminar-flow cabinet class 2 | Alpina | standard equipment | |
| MCF7-basedHAX1KD cell line | Cell line established in the National Institute of Oncology, Warsaw, described in Balcerak et al., 2019 | MCF7 cell line withHAX1knockdown | |
| MCF7 cell line (CONTROL) | ATCC | ATCC HTB-22 | epithelial, adherent breast cancer cell line |
| Olympus CK2 light microscope | Olympus | ||
| Paxillin | Abcam | ab32084 | rabbit, 1:250, Y113 |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Phalloidin-TRITC conjugate | Sigma | P1951 | 1:400 (stock 5 mg/mL in DMSO), actin labeling |
| PTX | Sigma | T7402-1MG | |
| TBST – NaCl | Sigma | S9888 | |
| TBST – Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9002-93-11 | |
| Zeiss LSM800 Confocal microscope | Zeiss |
References
- Li, D. S., Zimmermann, J., Levine, H. Modeling closure of circular wounds through coordinated collective motion. Search Results. 13 (1), 016006 (2016).
- Ilina, O., Friedl, P. Mechanisms of collective cell migration at a glance. Journal of Cell Science. 122, 3203-3208 (2009).
- Ladoux, B., Mege, R. M. Mechanobiology of collective cell behaviours. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (12), 743-757 (2017).
- Stossi, F., et al. High throughput microscopy identifies bisphenol AP, a bisphenol A analog, as a novel AR down-regulator. Oncotarget. 7 (13), 16962-16974 (2016).
- Legland, D., Arganda-Carreras, I., Andrey, P. MorphoLibJ: integrated library and plugins for mathematical morphology with ImageJ. Bioinformatics. 32 (22), 3532-3534 (2016).
- Balcerak, A., et al. HAX1 impact on collective cell migration, cell adhesion, and cell shape is linked to the regulation of actomyosin contractility. Molecular Biology of the Cell. 30 (25), 3024-3036 (2019).
- Buskermolen, A. B. C., Kurniawan, N. A., Bouten, C. V. C. An automated quantitative analysis of cell, nucleus and focal adhesion morphology. PLoS One. 13 (3), 0195201 (2018).
- Fokkelman, M., et al. Cellular adhesome screen identifies critical modulators of focal adhesion dynamics, cellular traction forces and cell migration behaviour. Scientific Reports. 6, 31707 (2016).
- Horzum, U., Ozdil, B., Pesen-Okvur, D. Step-by-step quantitative analysis of focal adhesions. MethodsX. 1, 56-59 (2014).
- Kim, D. H., Wirtz, D. Focal adhesion size uniquely predicts cell migration. FASEB Journal. 27 (4), 1351-1361 (2013).
- Pincus, Z., Theriot, J. A. Comparison of quantitative methods for cell-shape analysis. Journal of Microscopy. 227, 140-156 (2007).
- Tsygankov, D., et al. CellGeo: a computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries. Journal of Cell Biology. 204 (3), 443-460 (2014).
- Tiryaki, V. M., Adia-Nimuwa, U., Ayres, V. M., Ahmed, I., Shreiber, D. I. Texture-based segmentation and a new cell shape index for quantitative analysis of cell spreading in AFM images. Cytometry A. 87 (12), 1090-1100 (2015).
- Tong, J., et al. Cell micropatterning reveals the modulatory effect of cell shape on proliferation through intracellular calcium transients. Biochimica et Biophysica Acta. 1864 (12), 2389-2401 (2017).
- Vartanian, K. B., Kirkpatrick, S. J., Hanson, S. R., Hinds, M. T. Endothelial cell cytoskeletal alignment independent of fluid shear stress on micropatterned surfaces. Biochemical and Biophysical Research Communications. 371 (4), 787-792 (2008).
Cite This Article
Wakula, M., Balcerak, A., Smietanka, U., Chmielarczyk, M., Konopiński, R., Grzybowska, E. A. Quantification of Cell-Substrate Adhesion Area and Cell Shape Distributions in MCF7 Cell Monolayers. J. Vis. Exp. (160), e61461, doi:10.3791/61461 (2020).