Quantification des distributions de zone d’adhérence cellule-substrat et de forme cellulaire dans les monocouches cellulaires MCF7
Summary
L’article décrit la quantification de 1) la taille et le nombre d’adhérences focales et 2) l’indice de forme cellulaire et sa distribution à partir d’images confocales des monocouches confluentes des cellules MCF7.
Abstract
Les méthodes présentées ici quantifient certains paramètres des monocouches de cellules adhérentes confluentes à partir de multiples images confocales correctement tachées : adhérence au substrat en fonction du nombre et de la taille des adhérences focales, et de la forme cellulaire, caractérisée par l’indice de forme cellulaire et d’autres descripteurs de forme. Les adhérences focales ont été visualisées par la coloration de paxilline et les bordures de cellules-cellules ont été marquées par la plakoglobine de jonction et l’actine. Les méthodes de culture cellulaire et de coloration étaient standard; les images représentent des plans focals uniques; l’analyse d’image a été effectuée à l’aide d’un logiciel de traitement d’images accessible au public. Les protocoles présentés sont utilisés pour quantifier le nombre et la taille des adhérences focales et les différences dans la distribution de la forme cellulaire dans les monocouches, mais ils peuvent être réutilisés pour la quantification de la taille et de la forme de toute autre structure cellulaire distincte qui peut être tachée (p. ex., mitochondries ou noyaux). L’évaluation de ces paramètres est importante dans la caractérisation des forces dynamiques dans la couche cellulaire adhérente, y compris l’adhérence cellulaire et la contractilité de l’actomyosine qui affecte la forme cellulaire.
Introduction
Les monocouches épithéliales de cellules agissent comme un collectif dans lequel l’adhérence cellule-cellule et cellule-substrat ainsi que les forces contractiles et les tensions représentent des paramètres importants et leur juste équilibre contribue à l’intégrité globale de l’unité1,2,3. Ainsi, l’évaluation de ces paramètres représente un moyen d’établir l’état actuel de la couche cellulaire.
Les deux méthodes décrites ici représentent une analyse bidimensionnelle des monocouches confluentes des cellules épithéliales adhérentes (dans ce cas mcf7 ligne cellulaire de cancer du sein). L’analyse est effectuée à l’aide d’images confocales (seules tranches de Z) provenant de différentes régions de l’axe Z; région basale près d’un substrat pour les mesures d’adhérence focale (FA) et la région apicale pour les mesures de la forme cellulaire. Les méthodes présentées sont relativement simples et nécessitent des techniques de laboratoire standard et des logiciels open-source. La microscopie confocale est suffisante pour ce protocole, de sorte qu’elle peut être effectuée sans employer plus spécialisée tirf (total internal reflection Fluorescence) microscopie. Ainsi, le protocole pourrait être mis en œuvre dans un cadre de laboratoire relativement standard. Bien que l’exactitude des méthodes soit limitée, elles peuvent distinguer les différences de base dans l’adhérence focale et la forme cellulaire.
Les deux méthodes décrites ici consistent en les procédures expérimentales standard telles que la culture cellulaire, l’immunostaining, l’imagerie confocale et l’analyse d’image effectuées à l’aide de ImageJ. Toutefois, tout logiciel de traitement d’image avec les fonctions appropriées peut être utilisé. Les méthodes présentées peuvent suivre et comparer les changements subis par le traitement pharmacologique ou la modification génétique minimale. L’obtention de valeurs précises n’est pas recommandée, en raison de la précision limitée de ces méthodes. Deux macros automatisées ont été incluses, afin de faciliter la mesure de nombreuses images.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’adhérence cellule-cellule et cell-substrat constitue des attributs inhérents des cellules épithéliales et jouent le rôle critique dans la morphogenèse des tissus et l’embriogenèse. Dans les tissus adultes, la régulation appropriée des propriétés mécaniques de la couche cellulaire est cruciale pour maintenir l’homéostasie et prévenir les réponses pathologiques comme la progression et la métastase de tumeur. La taille et le nombre d’adhérences focales dépendent de la force de l’adhérence cell…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été soutenus par le Centre national polonais des sciences sous la subvention no 2014/14/M/NZ1/00437.
Materials
| Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A32740 | goat anti-rabbit, 1:500 |
| Ammonium chloride | Sigma | A9434 | |
| BSA | BioShop | ALB001.500 | |
| Collagen from calf skin | Sigma | C9791-10MG | |
| DAPI | Sigma | D9542 | 1:10000 (stock 1 mg/mL in H2O), nucleic acid staining |
| DMEM + GlutaMAX, 1 g/L D-Glucose, Pyruvate | ThermoFisher Scientific | 21885-025 | |
| FBS | ThermoFisher Scientific | 10270-136 | |
| Junction plakoglobin | Cell Signaling | 2309S | rabbit, 1:400 |
| Laminar-flow cabinet class 2 | Alpina | standard equipment | |
| MCF7-basedHAX1KD cell line | Cell line established in the National Institute of Oncology, Warsaw, described in Balcerak et al., 2019 | MCF7 cell line withHAX1knockdown | |
| MCF7 cell line (CONTROL) | ATCC | ATCC HTB-22 | epithelial, adherent breast cancer cell line |
| Olympus CK2 light microscope | Olympus | ||
| Paxillin | Abcam | ab32084 | rabbit, 1:250, Y113 |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Phalloidin-TRITC conjugate | Sigma | P1951 | 1:400 (stock 5 mg/mL in DMSO), actin labeling |
| PTX | Sigma | T7402-1MG | |
| TBST – NaCl | Sigma | S9888 | |
| TBST – Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9002-93-11 | |
| Zeiss LSM800 Confocal microscope | Zeiss |
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