성인 프레리 볼레스의 신경질성 틈새에서 파생된 신경구 의 문화
Summary
우리는 뇌원내에서 신경 전구세포를 배양하고, 대초원의 성인 뇌의 자이루스를 배양하는 조건을 확립하고, 체외 연구의 보완적인 것으로, 사회적 행동과 관련된 기능성 플라스틱 변화의 일부가 될 수 있는 신경성 틈새 시장 간의 성 의존적 차이를 분석하였다.
Abstract
신경구는 신경 줄기 세포와 전구 세포를 포함하는 1 차세포 집계입니다. 이러한 3D 구조는 신경 줄기 세포의 분화 및 확산 잠재력을 결정할 뿐만 아니라 시간이 지남에 따라 분석될 수 있는 세포주를 생성하는 훌륭한 도구입니다. 또한, 신경 구는 틈새 시장을 만들 수 있습니다 (체 외) 동적 변화 환경의 모델링을 허용, 다양 한 성장 인자 등, 호르몬, 신경 전달 물질, 다른 사람의 사이에서. 마이크로투스 오크로가스터(대초원 vole)는 사회 성 행동과 사회적 인식의 신경생물학적 기초를 이해하는 독특한 모델입니다. 그러나 이러한 동작과 관련된 세포 메커니즘은 잘 알려져 있지 않습니다. 이 프로토콜은 신경구를 생성하기 위해 비 준수 조건하에서 배양되는 성인 대초원의 신경 성 틈새에서 신경 전구 세포를 얻는 것을 목표로합니다. 신경구의 크기와 수는 지역 (서브 벤토리 영역 또는 dentate gyrus) 및 대초원 vole의 섹스에 따라 달라집니다. 이 방법은 시험관 내 신경 성 틈새 에서 성에 의존적인 차이와 쌍 결합 및 쌍 부모 치료와 같은 사회적 행동과 관련된 신경 가소성 변화를 연구하는 놀라운 도구입니다. 또한 사회적 상호 작용 (자폐증 스펙트럼 장애 및 정신 분열증)의 적자를 수반하는 인지 상태를 검사 할 수 있었습니다.
Introduction
크리스티대 가족의 일원인 대초원볼(마이크로투스 오크로가스터)은사회적으로 일부일처화하고 사교적인 종으로 생활 전략이 발전하는 작은 포유류입니다. 남성과 여성 모두 결합 후 지속적인 쌍 유대를 설정하거나 둥지를 공유, 자신의 영토를 방어, 자신의 자손에 대한 양부모 치료를 표시 하는특징의긴 기간1,2,3,4. 따라서, 대초원 볼은 사회 인식5에서사회 성 행동 및 손상의 신경 생물학적 기초를 이해하는 귀중한 모델이다.
성인 신경 발생은 행동 변화로 이어지는 신경 가소성의 가장 중요한 과정 중 하나입니다. 예를 들어, 우리의 연구 그룹은 해마의 축산 자이러스 (DG)에서 세포 증식을 증가 결합과 사회적 동거가 남성 voles에서보고, 성인 신경 발생이 대초원 voles에서 짝짓기하여 유도 쌍 결합의 형성에 역할을 할 수 있음을 시사 (출판되지 않은 데이터). 한편, 새로운 뉴런이 생성되고 통합되는 뇌 영역은 잘 알려져 있지만, 이러한 과정에 관여하는 분자 및 세포 메커니즘은 전체 뇌 모델6의기술적 단점으로 인해 결정되지 않은 상태로 남아 있다. 예를 들어, 유전자 발현 및 기타 세포 활동을 제어하는 신호 경로는 비교적 짧은 활성화 기간(인포프로테온의 검출)7을갖는다. 한 가지 대체 모델은 성인 신경 발생에 관여하는 분자 성분을 해명하기 위해 성인 신경 줄기 세포 또는 전구 세포를 분리하고 배양합니다.
성인 포유동물(mouse) 뇌로부터 체외 신경 전구체를 유지하는 첫 번째 접근법은 신경세포를 생성하는 다능성 잠재력을 보존하는 비응성 조건하에서 성장하는 세포 집계인 신경권의 분석과 성상세포8,9,10이었다. 이들의 발달 과정에서, 전구체만이 피피성장인자(EGF) 및 섬유아세포 성장인자 2(FGF2)와 같은 미토겐에 반응하여 증식하고 신경구를 생성하는 선택 과정이 있다8,9,10.
우리의 지식에, 어떤 프로토콜은 대초원 voles에서 성인 신경 선조를 얻기 위해 문학에서보고되지 않습니다. 여기에서, 우리는 신경질 틈새 에서 신경 선조및 신경권 형성 분석을 통해 그들의 체외 유지를 격리하는 배양 조건을 설치했습니다. 따라서, 실험은 신경 줄기 세포 및 선조의 증식, 마이그레이션, 분화 및 생존에 관여하는 분자 및 세포 메커니즘을 식별하도록 설계될 수 있으며, 대초원 vole에서 아직 알려지지 않은 공정. 더욱이, VZ와 DG에서 파생된 세포의 성질에 있는 체외 다름을 해명하는 것은 사회 성적인 행동 및 인지 행동의 변화와 관련되었던 신경 가소성에 있는 신경성 틈새 소각의 역할에 관하여 정보를 제공할 수 있고, 사회적인 상호 작용에 있는 적자 (자폐증 스펙트럼 무질서 및 정신 분열증), 또한 성 의존적일 수 있었습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
신경 줄기 세포 배양을 얻는 단계는 효소 용액을 가진 소화 기간이며, 이는 세포 생존가능성을 감소시킬 수 있기 때문에 30분 이상을 초과해서는 안 된다. 신경구는 초기 문화 후에 8-10 일에 나타나야 합니다; 12일째에 나타나지 않으면 문화를 버리고 실험을 반복하여 소화 기간을 줄입니다. 또 다른 문제는 뇌 조직을 커버 하는 혈관. 적혈구의 과잉신경구 형성을 방해할 수 있기 때문에 해부 도중 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 CONACYT 252756 및 253631을 보조금에 의해 지원되었다; UNAM-DGAPA-PAPIIT IN202818 및 IN203518; INPER 2018-1-163, and NIH P51OD11132. 우리는 Deisy Gasca, 카를로스 로자노, 마르틴 가르시아, 알레한드라 카스티야, 니디아 에르난데스, 제시카 노리스, 수사나 카스트로의 뛰어난 기술 지원에 감사드립니다.
Materials
| Antibodies | Antibody ID | ||
| Anti-Nestin | GeneTex | GTX30671 | RRID:AB_625325 |
| Anti-Doublecortin | MERCK | AB2253 | RRID:AB_1586992 |
| Anti-Ki67 | Abcam | ab66155 | RRID:AB_1140752 |
| Anti-MAP2 | GeneTex | GTX50810 | RRID:AB_11170769 |
| Anti-GFAP | SIGMA | G3893 | RRID:AB_477010 |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | RRID:AB_2534088 |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11036 | RRID:AB_10563566 |
| Goat Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11073 | RRID:AB_2534117 |
| Culture reagents | |||
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 15240062 | 100X |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17504044 | 50X |
| Collagenase, Type IV | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17104019 | Powder |
| Dispase | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17105041 | Powder |
| DMEM/F12, HEPES | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11330032 | |
| Glucose | any brand | Powder, Cell Culture Grade | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 35050061 | 100X |
| HEPES | any brand | Powder, Cell Culture Grade | |
| Mouse Laminin | Corning | 354232 | 1 mg/mL |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17502048 | 100X |
| NAHCO3 | any brand | Powder, Suitable for Cell Culture | |
| Neurobasal | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 21103049 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10010023 | 1X |
| Poly-L-ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P3655 | Powder |
| Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | AF-100-18B | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher Scientific/Gibco | A1110501 | 100 mL |
| Disposable material | |||
| 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3473 | |
| 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3526 | |
| 40 µm Cell Strainer | Corning/Falcon | 352340 | Blue |
| Bottle Top Vacuum Filter, 0.22 µm pore | Corning | 431118 | PES membrane, 45 mm diameter neck |
| Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube | any brand | with conical bottom | |
| Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl. | any brand | ||
| Sterile cotton gauzes | |||
| Sterile microcentrifuge tubes of 1.5 mL | any brand | ||
| Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL | any brand | ||
| Sterile surgical gloves | any brand | ||
| Syringe Filters, 0.22 µm pore | Merk Millipore | SLGPR33RB | Polyethersulfone (PES) membrane, 33 mm diameter |
| Equipment and surgical instruments | |||
| Biological safety cabinet | |||
| Dissecting Scissors | |||
| Dumont Forceps | |||
| Motorized Pipet Filler/Dispenser | |||
| Micropipettes | |||
| Petri Dishes | |||
| Scalpel Blades | |||
| Stainless-steel Spatula |
References
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