תרבות הנוירוספירות הנגזרות מהנישות הנוירוגניות בערבה בוגרת וול
Summary
הקמנו את התנאים לתאי האבות העצביים של התרבות מהתת-ונטריקולרי ולתהדר את המוח הבוגר של הערבה, כמשלים במחקר מבחנה, כדי לנתח את ההבדלים התלויים במין בין גומחות נוירוגניות שיכולות להיות חלק משינויים פלסטיים פונקציונליים הקשורים להתנהגויות חברתיות.
Abstract
נוירוספירות הן אגרגטים של תאים עיקריים המרכיבים תאי גזע עצביים ותאי ם. מבנים תלת-מית-מיוד אלה הם כלי מצוין כדי לקבוע את פוטנציאל ההבידול וההתפשטות של תאי גזע עצביים, כמו גם ליצור קווי תאים ממה שניתן לומר לאורך זמן. כמו כן, נוירוספירות יכולות ליצור נישה (במבחנה) המאפשרת מידול של הסביבה המשתנה דינמי, כגון גורמי גדילה שונים, הורמונים, נוירוטרנסמיטורים, בין היתר. מיקרוטוס ochrogaster (בערבה vole) הוא מודל ייחודי להבנת הבסיס הנוירוביולוגי של התנהגויות חברתיות-מיניות וקוגניציה חברתית. עם זאת, המנגנונים הסלולריים המעורבים בהתנהגויות אלה אינם ידועים היטב. הפרוטוקול נועד להשיג תאים עצביים האבות מן הנישות הנוירוגניות של vole הערבה למבוגרים, אשר תרבותיים בתנאים שאינם דבקים, כדי ליצור נוירוספירות. הגודל והמספר של נוירוספירות תלויים באזור (אזור תת-זוויתי או גירוס דנת) ומין של vole הערבה. שיטה זו היא כלי יוצא דופן כדי ללמוד הבדלים תלויי מין נישות נוירוגניות במבחנה ואת השינויים neuroplasticity הקשורים התנהגויות חברתיות כגון מליטה זוג וטיפול דו-הורנטלי. כמו כן, ניתן לבחון מצבים קוגניטיביים הכרוכים בגירעונות באינטראקציות חברתיות (הפרעות בספקטרום האוטיסטי וסכיזופרניה).
Introduction
הערבה וול(Microtus ochrogaster),חברה בממשפחה קריסטיידה, היא יונק קטן שאסטרטגיית חייו מתפתחת כזן מונוגמי וחברתי מאוד. גם זכרים וגם נקבות יוצרים קשר זוגי מתמשך לאחר הזדווגות או תקופות ארוכות של חיים משותפים המאופיין בשיתוף הקן, בהגנה על הטריטוריה שלהם, והצגת טיפול דו-רנטליעבור ציניהם 1,2,3,4. לכן, vole הערבה הוא מודל בעל ערך להבנת הבסיס הנוירוביולוגי של התנהגות חברתית-מינית וליקויים בקוגניציהחברתית 5.
נוירוגנזה למבוגרים היא אחד התהליכים החשובים ביותר של פלסטיות עצבית שמובילה לשינויים התנהגותיים. לדוגמה, קבוצת המחקר שלנו דיווחה בגברים כי שיתוף פעולה חברתי עם הזדווגות גדל התפשטות תאים באזור subventricular (VZ) ואת האזור subgranular ב גירוס dentate (DG) של ההיפוקמפוס, מציע כי neurogenesis למבוגרים יכול לשחק תפקיד בהתהוות של מליטה זיווג המושרה על ידי הזדווגות בערבה voles (נתונים שלא פורסם). מצד שני, למרות אזורי המוח שבו נוירונים חדשים נוצרים ומשולבים ידועים היטב, המנגנונים המולקולריים והסלולריים המעורבים בתהליכים אלה נשארים לא נקבעו בשל חסרונות טכניים בכל מודל המוח6. לדוגמה, מסלולי האיתות השולטים בביטוי גנים ובפעילויות תאיות אחרות יש תקופת הפעלה קצרה יחסית (זיהוי של פוספורוטום)7. מודל חלופי אחד הוא מבודד ותרבותי תאי גזע עצביים למבוגרים או תאים רבי דרך כדי להברר רכיבים מולקולריים מעורבים neurogenesis למבוגרים.
הגישה הראשונה לשמור על מבשרים עצביים מבחנה ממוח יונקים בוגרים (עכבר) הייתה ההסתה של נוירוספירות, שהם אגרגטים תאיים הגדלים בתנאים שאינם דבקים אשר משמרים את הפוטנציאל הרב-תכליתי שלהם ליצור נוירונים,כמו גם אסטרוציטים 8,9,10. במהלך הפיתוח שלהם, יש תהליך בחירה שבו רק מבשרים יגיבו מיטוגנים כגון גורם גדילה אפידרמיס (EGF) ופיברובלסט גורם גדילה 2 (FGF2) כדי להתרבות וליצור נוירוספירות8,9,10.
למיטב ידיעתנו, לא דווח על פרוטוקול בספרות כדי להשיג אנשים עצביים בוגרים מ”ערבה וול”. כאן, ביססנו את תנאי התרבות כדי לבודד אבות עצביים מתוך נישות נוירוגניות ותחזוקת המבחנה שלהם באמצעות היווצרות נוירוספרה. לפיכך, ניתן לתווך ניסויים כדי לזהות את המנגנונים המולקולריים והסלולריים המעורבים בהתפשטות, הגירה, בידול והישרדות של תאי גזע עצביים וקרבות, תהליכים שעדיין אינם ידועים בערבה. יתר על כן, ההברה בהבדלים במבחנה במאפייני התאים הנגזרים VZ ו- DG יכול לספק מידע על התפקיד של נישות נוירוגניות ב פלסטיות עצבית הקשורים לשינויים בהתנהגות חברתית-מינית והתנהגויות קוגניטיביות, וגירעונות באינטראקציות חברתיות (הפרעת הספקטרום האוטיסטי וסכיזופרניה), אשר יכול להיות גם תלוי מין.
Protocol
Representative Results
Discussion
שלב כדי להשיג תרבות תאי גזע עצביים היא תקופת העיכול עם הפתרון אנזימטי, אשר לא צריך לחרוג יותר מ 30 דקות כי זה עלול להקטין את הכדאיות של התא. נוירוספירות צריך להופיע ב 8-10 ימים לאחר התרבות הראשונית; אם הם לא יופיעו ביום ה-12, בטלו את התרבות וחזרו על הניסוי, תוך צמצום תקופת העיכול. בעיה נוספת היא כל…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי מענקים CONACYT 252756 ו 253631; אונום-דגפה-פאפיט ב-202818 וב-203518; INPER 2018-1-163, ו- NIH P51OD11132. אנו מודים דיסי גסקה, קרלוס Lozano, מרטין García, אלחנדרה קסטיליה, נדיה הרננדז, ג’סיקה נוריס וסוזן קסטרו על הסיוע הטכני המצוין שלהם.
Materials
| Antibodies | Antibody ID | ||
| Anti-Nestin | GeneTex | GTX30671 | RRID:AB_625325 |
| Anti-Doublecortin | MERCK | AB2253 | RRID:AB_1586992 |
| Anti-Ki67 | Abcam | ab66155 | RRID:AB_1140752 |
| Anti-MAP2 | GeneTex | GTX50810 | RRID:AB_11170769 |
| Anti-GFAP | SIGMA | G3893 | RRID:AB_477010 |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | RRID:AB_2534088 |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11036 | RRID:AB_10563566 |
| Goat Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11073 | RRID:AB_2534117 |
| Culture reagents | |||
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 15240062 | 100X |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17504044 | 50X |
| Collagenase, Type IV | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17104019 | Powder |
| Dispase | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17105041 | Powder |
| DMEM/F12, HEPES | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11330032 | |
| Glucose | any brand | Powder, Cell Culture Grade | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 35050061 | 100X |
| HEPES | any brand | Powder, Cell Culture Grade | |
| Mouse Laminin | Corning | 354232 | 1 mg/mL |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17502048 | 100X |
| NAHCO3 | any brand | Powder, Suitable for Cell Culture | |
| Neurobasal | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 21103049 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10010023 | 1X |
| Poly-L-ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P3655 | Powder |
| Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | AF-100-18B | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher Scientific/Gibco | A1110501 | 100 mL |
| Disposable material | |||
| 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3473 | |
| 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3526 | |
| 40 µm Cell Strainer | Corning/Falcon | 352340 | Blue |
| Bottle Top Vacuum Filter, 0.22 µm pore | Corning | 431118 | PES membrane, 45 mm diameter neck |
| Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube | any brand | with conical bottom | |
| Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl. | any brand | ||
| Sterile cotton gauzes | |||
| Sterile microcentrifuge tubes of 1.5 mL | any brand | ||
| Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL | any brand | ||
| Sterile surgical gloves | any brand | ||
| Syringe Filters, 0.22 µm pore | Merk Millipore | SLGPR33RB | Polyethersulfone (PES) membrane, 33 mm diameter |
| Equipment and surgical instruments | |||
| Biological safety cabinet | |||
| Dissecting Scissors | |||
| Dumont Forceps | |||
| Motorized Pipet Filler/Dispenser | |||
| Micropipettes | |||
| Petri Dishes | |||
| Scalpel Blades | |||
| Stainless-steel Spatula |
References
- Portillo, W., Paredes, R. G. Motivational Drive in Non-copulating and Socially Monogamous Mammals. Frontiers Behavioral Neuroscience. 13, 238 (2019).
- Walum, H., Young, L. J. The neural mechanisms and circuitry of the pair bond. Nature Reviews Neurosciences. 19 (11), 643-654 (2018).
- Gobrogge, K. L. Sex, drugs, and violence: neuromodulation of attachment and conflict in voles. Current Topics Behavioral Neurosciences. 17, 229-264 (2014).
- Perkeybile, A. M., Bales, K. L. Intergenerational transmission of sociality: the role of parents in shaping social behavior in monogamous and non-monogamous species. Journal of Experimental Biology. 220, 114-123 (2017).
- McGraw, L. A., Young, L. J. The prairie vole: an emerging model organism for understanding the social brain. Trends in Neuroscience. 33 (2), 103-109 (2010).
- Fowler, C. D., Liu, Y., Ouimet, C., Wang, Z. The effects of social environment on adult neurogenesis in the female prairie vole. Journal of Neurobiology. 51 (2), 115-128 (2002).
- Yang, P., et al. Multi-omic Profiling Reveals Dynamics of the Phased Progression of Pluripotency. Cell Systems. 8 (5), 427-445 (2019).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Gritti, A., et al. Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor. Journal of Neurosciences. 16 (3), 1091-1100 (1996).
- Ostenfeld, T., Svendsen, C. N. Requirement for neurogenesis to proceed through the division of neuronal progenitors following differentiation of epidermal growth factor and fibroblast growth factor-2-responsive human neural stem cells. Stem Cells. 22 (5), 798-811 (2004).
- Paxinos, G., Keith, B. J. F. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2001).
- Conti, L., Cattaneo, E. Neural stem cell systems: physiological players or in vitro entities. Nature Reviews Neuroscience. 11 (3), 176-187 (2010).
- Lieberwirth, C., Liu, Y., Jia, X., Wang, Z. Social isolation impairs adult neurogenesis in the limbic system and alters behaviors in female prairie voles. Hormones and Behavior. 62 (4), 357-366 (2012).
- Ruscio, M. G., et al. Pup exposure elicits hippocampal cell proliferation in the prairie vole. Behavioral Brain Research. 187 (1), 9-16 (2008).
- Wojtowicz, J. M., Kee, N. BrdU assay for neurogenesis in rodents. Nature Protocols. 1 (3), 1399-1405 (2006).
- Eack, S. M., et al. Commonalities in social and non-social cognitive impairments in adults with autism spectrum disorder and schizophrenia. Schizophrenia Research. 148 (1-3), 24-28 (2013).
- Pinkham, A. E., et al. Comprehensive comparison of social cognitive performance in autism spectrum disorder and schizophrenia. Psychological Medicine. , 1-9 (2019).
- Yirmiya, N., et al. Association between the arginine vasopressin 1a receptor (AVPR1a) gene and autism in a family-based study: mediation by socialization skills. Molecular Psychiatry. 11 (5), 488-494 (2006).
- Montag, C., et al. Oxytocin and oxytocin receptor gene polymorphisms and risk for schizophrenia: a case-control study. The World Journal of Biological Psychiatry. 14 (7), 500-508 (2013).
- Harony, H., Wagner, S. The contribution of oxytocin and vasopressin to mammalian social behavior: potential role in autism spectrum disorder. Neurosignals. 18 (2), 82-97 (2010).
- Bachner-Melman, R., Ebstein, R. P. The role of oxytocin and vasopressin in emotional and social behaviors. Handbook of Clinical Neurology. 124, 53-68 (2014).
- Wegiel, J., et al. The neuropathology of autism: defects of neurogenesis and neuronal migration, and dysplastic changes. Acta Neuropathologica. 119 (6), 755-770 (2010).
- Kaushik, G., Zarbalis, K. S. Prenatal Neurogenesis in Autism Spectrum Disorders. Frontiers in Chemistry. 4, 12 (2016).
- Sheu, J. R., et al. A Critical Period for the Development of Schizophrenia-Like Pathology by Aberrant Postnatal Neurogenesis. Frontiers in Neuroscience. 13, 635 (2019).
- Donaldson, Z. R., Young, L. J. The relative contribution of proximal 5′ flanking sequence and microsatellite variation on brain vasopressin 1a receptor (Avpr1a) gene expression and behavior. PLoS Genetics. 9 (8), 1003729 (2013).
- Rice, M. A., Hobbs, L. E., Wallace, K. J., Ophir, A. G. Cryptic sexual dimorphism in spatial memory and hippocampal oxytocin receptors in prairie voles (Microtus ochrogaster). Hormones and Behavior. 95, 94-102 (2017).
