Summary

Cultura delle Neurosfere Derivate dalle Nicchie Neurogeniche nelle Arvicole Della Prateria Adulta

Published: June 10, 2020
doi:

Summary

Abbiamo stabilito le condizioni per coltura delle cellule progenitrici neurali dalla zona subventricolare e dentare il giro del cervello adulto delle arvicole della prateria, come studio complementare in vitro, per analizzare le differenze dipendenti dal sesso tra nicchie neurogeniche che potrebbero far parte dei cambiamenti plastici funzionali associati ai comportamenti sociali.

Abstract

Le neurosfere sono aggregati cellulari primari che comprendono cellule staminali neurali e cellule progenitrici. Queste strutture 3D sono uno strumento eccellente per determinare il potenziale di differenziazione e proliferazione delle cellule staminali neurali, nonché per generare linee cellulari di quanto possa essere analizzato nel tempo. Inoltre, le neurosfere possono creare una nicchia (in vitro) che consente la modellazione dell’ambiente dinamico che cambia, come diversi fattori di crescita, ormoni, neurotrasmettitori, tra gli altri. Microtus ochrogaster (prateria arvicola) è un modello unico per comprendere le basi neurobiologiche dei comportamenti socio-sessuali e della cognizione sociale. Tuttavia, i meccanismi cellulari coinvolti in questi comportamenti non sono ben noti. Il protocollo mira ad ottenere cellule progenitrici neurali dalle nicchie neurogeniche della prateria adulta, che sono coltivate in condizioni non aderenti, per generare neurosfere. Le dimensioni e il numero di neurosfere dipendono dalla regione (zona subventricolare o giro dentato) e dal sesso dell’arvicola della prateria. Questo metodo è uno strumento notevole per studiare le differenze dipendenti dal sesso nelle nicchie neurogeniche in vitro e i cambiamenti di neuroplasticità associati a comportamenti sociali come il legame tra coppie e la cura biparentale. Inoltre, potrebbero essere esaminate le condizioni cognitive che comportano deficit nelle interazioni sociali (disturbi dello spettro autistico e schizofrenia).

Introduction

La prateria(Microtus ochrogaster),un membro della famiglia Cricetidae, è un piccolo mammifero la cui strategia di vita si sviluppa come specie socialmente monogama e altamente socievole. Sia i maschi che le femmine stabiliscono un legame duraturo di coppia dopo l’accoppiamento o lunghi periodi di convivenza caratterizzati dalla condivisione del nido, dalla difesa del loro territorio e dall’esposizione di cure biparentali per la loro progenie1,2,3,4. Pertanto, l’arvicola della prateria è un modello prezioso per comprendere le basi neurobiologiche del comportamento socio-sessuale e delle menomazioni nella cognizione sociale5.

La neurogenesi adulta è uno dei processi più importanti della plasticità neurale che porta a cambiamenti comportamentali. Ad esempio, il nostro gruppo di ricerca ha riferito nelle arvicole maschili che la convivenza sociale con accoppiamento ha aumentato la proliferazione cellulare nella zona subventricolare (VZ) e nella zona subgranulare nel giro dentato (DG) dell’ippocampo, suggerendo che la neurogenesi adulta può svolgere un ruolo nella formazione del legame di coppia indotto dall’accoppiamento nelle arvicole della prateria (dati inediti). D’altra parte, sebbene le regioni cerebrali in cui vengono generati e integrati nuovi neuroni siano ben note, i meccanismi molecolari e cellulari coinvolti in questi processi rimangono indeterminati a causa di inconvenienti tecnici nell’intero modellocerebrale 6. Ad esempio, le vie di segnalazione che controllano l’espressione genica e altre attività cellulari hanno un periodo di attivazione relativamente breve (rilevamento del fosfoproteoma)7. Un modello alternativo è le cellule staminali neurali adulte isolate e coltivate o le cellule progenitrici per chiarire i componenti molecolari coinvolti nella neurogenesi adulta.

Il primo approccio per mantenere i precursori neurali in vitro del cervello di mammiferi adulti (topo) è stato il test delle neurosfere, che sono aggregati cellulari che crescono in condizioni non aderenti che preservano il loro potenziale multipotente per generare neuroni, così come gli astrociti8,9,10. Durante il loro sviluppo, c’è un processo di selezione in cui solo i precursori risponderanno a mitogeni come il fattore di crescita epidermico (EGF) e il fattore di crescita dei fibroblasti 2 (FGF2) per proliferare e generare neurosfere8,9,10.

A nostra conoscenza, nessun protocollo è riportato in letteratura per ottenere progenitori neurali adulti dalle arvicole della prateria. Qui, abbiamo stabilito le condizioni di coltura per isolare i progenitori neuronali dalle nicchie neurogeniche e il loro mantenimento in vitro attraverso il test di formazione della neurosfera. Pertanto, gli esperimenti possono essere progettati per identificare i meccanismi molecolari e cellulari coinvolti nella proliferazione, migrazione, differenziazione e sopravvivenza delle cellule staminali neurali e dei progenitori, processi che sono ancora sconosciuti nell’arvicola della prateria. Inoltre, chiarire le differenze in vitro nelle proprietà delle cellule derivate dalla VZ e dalla DG potrebbe fornire informazioni sul ruolo delle nicchie neurogeniche nella plasticità neurale associate ai cambiamenti nel comportamento socio-sessuale e nei comportamenti cognitivi e ai deficit nelle interazioni sociali (disturbo dello spettro autistico e schizofrenia), che potrebbero anche dipendere dal sesso.

Protocol

Lo studio è stato approvato dal Comitato etico della ricerca dell’Instituto de Neurobiología, universidad nacional autónoma de México, Messico e Instituto Nacional de Perinatologia (2018-1-163). La riproduzione, la cura e gli endpoint umani degli animali sono stati stabiliti seguendo lo standard ufficiale messicano (NOM-062-Z00-1999) basato sul “Ley General de Salud en Materia de Investigación para la Salud” (Legge generale sulla salute per la ricerca sanitaria) della Secretaria della Salute messicana. <p class=…

Representative Results

Le neurosfere erano formate da cellule staminali neurali isolate dalla VZ e dalla DG di arvicole di prateria adulta sia femminile che maschile. Circa 8-10 giorni dopo aver iniziato la coltura, le cellule avrebbero dovuto formare le neurosfere. Si noti che la piastra può contenere detriti nella coltura primaria (Figura 3A). Tuttavia, nel passaggio 1 la coltura dovrebbe consistere solo di neurosfere (Figura 3B). Un numero maggiore di n…

Discussion

Uno stadio per ottenere una coltura di cellule staminali neurali è il periodo di digestione con la soluzione enzimatica, che non dovrebbe superare i 30 minuti perché potrebbe diminuire la vitalità cellulare. Le neurosfere dovrebbero emergere a 8-10 giorni dopo la cultura iniziale; se non emergono entro il giorno 12, scartare la coltura e ripetere l’esperimento, riducendo il periodo di digestione. Un altro problema sono i vasi sanguigni che coprono il tessuto cerebrale. Dovrebbero essere completamente rimossi durante l…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questa ricerca fu sostenuta da sovvenzioni CONACYT 252756 e 253631; UNAM-DGAPA-PAPIIT NEL 202818 e NEL 203518; INPER 2018-1-163 e NIH P51OD11132. Ringraziamo Deisy Gasca, Carlos Lozano, Martín García, Alejandra Castilla, Nidia Hernandez, Jessica Norris e Susana Castro per l’eccellente assistenza tecnica.

Materials

Antibodies Antibody ID
Anti-Nestin GeneTex GTX30671 RRID:AB_625325
Anti-Doublecortin MERCK AB2253 RRID:AB_1586992
Anti-Ki67 Abcam ab66155 RRID:AB_1140752
Anti-MAP2 GeneTex GTX50810 RRID:AB_11170769
Anti-GFAP SIGMA G3893 RRID:AB_477010
Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11029 RRID:AB_2534088
Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 Thermo Fisher Scientific A-11036 RRID:AB_10563566
Goat Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11073 RRID:AB_2534117
Culture reagents
Antibiotic-Antimycotic Thermo Fisher Scientific/Gibco 15240062 100X
B-27 supplement Thermo Fisher Scientific/Gibco 17504044 50X
Collagenase, Type IV Thermo Fisher Scientific/Gibco 17104019 Powder
Dispase Thermo Fisher Scientific/Gibco 17105041 Powder
DMEM/F12, HEPES Thermo Fisher Scientific/Gibco 11330032
Glucose any brand Powder, Cell Culture Grade
GlutaMAX Thermo Fisher Scientific/Gibco 35050061 100X
HEPES any brand Powder, Cell Culture Grade
Mouse Laminin Corning 354232 1 mg/mL
N-2 supplement Thermo Fisher Scientific/Gibco 17502048 100X
NAHCO3 any brand Powder, Suitable for Cell Culture
Neurobasal Thermo Fisher Scientific/Gibco 21103049
Phosphate-Buffered Saline (PBS) Thermo Fisher Scientific/Gibco 10010023 1X
Poly-L-ornithine hydrobromide Sigma-Aldrich P3655 Powder
Recombinant Human EGF Peprotech AF-100-15
Recombinant Human FGF-basic Peprotech AF-100-18B
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Thermo Fisher Scientific/Gibco A1110501 100 mL
Disposable material
24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates Corning/Costar 3473
24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates Corning/Costar 3526
40 µm Cell Strainer Corning/Falcon 352340 Blue
Bottle Top Vacuum Filter, 0.22 µm pore Corning 431118 PES membrane, 45 mm diameter neck
Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube any brand with conical bottom
Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl. any brand
Sterile cotton gauzes
Sterile microcentrifuge tubes of 1.5 mL any brand
Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL any brand
Sterile surgical gloves any brand
Syringe Filters, 0.22 µm pore Merk Millipore SLGPR33RB Polyethersulfone (PES) membrane, 33 mm diameter
Equipment and surgical instruments
Biological safety cabinet
Dissecting Scissors
Dumont Forceps
Motorized Pipet Filler/Dispenser
Micropipettes
Petri Dishes
Scalpel Blades
Stainless-steel Spatula

References

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Ávila-González, D., Young, L. J., Camacho, F., Paredes, R. G., Díaz, N. F., Portillo, W. Culture of Neurospheres Derived from the Neurogenic Niches in Adult Prairie Voles. J. Vis. Exp. (160), e61402, doi:10.3791/61402 (2020).

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