Kinetische Visualisierung von einzelzelligen Interspezies-Bakterien-Wechselwirkungen
Summary
Dieses live-bakterielle Zellbildgebungsprotokoll ermöglicht die Visualisierung von Wechselwirkungen zwischen mehreren Bakterienarten auf einzelzelliger Ebene im Laufe der Zeit. Die Zeitraffer-Bildgebung ermöglicht die Beobachtung jeder Bakterienart in Monokultur oder Kokultur, um Wechselwirkungen zwischen den Arten in bakteriengemeinschaften mit mehreren Arten, einschließlich individueller Zellbeweglichkeit und Lebensfähigkeit, zu untersuchen.
Abstract
Polymikrobielle Gemeinschaften sind allgegenwärtig, aber ihre Wechselwirkungen auf einzelliger Ebene zu untersuchen, ist schwierig. So wurde eine mikroskopiebasierte Methode entwickelt, um Wechselwirkungen zwischen zwei bakteriellen Krankheitserregern zwischen den Spezies zu beobachten. Die Verwendung dieser Methode zur Hinterfragtwerden von Wechselwirkungen zwischen einem motilen Gram-negativen Erreger, Pseudomonas aeruginosa und einem nicht-motilen Gram-positiven Erreger, Staphylococcus aureus, wird hier demonstriert. Dieses Protokoll besteht darin, jede Spezies zwischen einem Coverslip und einem Agarosepad zu impfen, das die Zellen in einer einzigen Ebene aufrechterhält und die Visualisierung bakterieller Verhaltensweisen in Raum und Zeit ermöglicht.
Darüber hinaus ist die hier gezeigte Zeitraffermikroskopie ideal, um die frühen Wechselwirkungen zwischen zwei oder mehr Bakterienarten zu visualisieren, einschließlich Veränderungen der Beweglichkeit bakterieller Arten in der Monokultur und in der Kokultur mit anderen Arten. Aufgrund der Art des begrenzten Probenraums im Mikroskopie-Setup ist dieses Protokoll weniger anwendbar für die Untersuchung späterer Wechselwirkungen zwischen bakteriellen Arten, sobald die Zellpopulationen zu hoch sind. Es gibt jedoch verschiedene Anwendungen des Protokolls, die die Verwendung von Färbung enthoben für die Bildgebung lebender und abgestorbener Bakterienzellen, die Quantifizierung der Gen- oder Proteinexpression durch fluoreszierende Reporter und die Verfolgung der bakteriellen Zellbewegung sowohl in Einzelarten als auch bei Mehrartenexperimenten umfassen.
Introduction
Polymikrobielle Gemeinschaften sind in der Natur weit verbreitet und umfassen eine Vielzahl vonUmwelt-1,2,3 und menschlichen Nischen4,5. Zu den berüchtigtsten polymikrobiellen Infektionen bei menschlichen Erkrankungen gehören Zahnbiofilme6, chronische Wunden7,8, und Atemwegsinfektionen bei Personen mit chronisch obstruktiver Lungenerkrankung9, Beatmungs-assoziierte Lungenentzündung10, und die genetische Krankheit Mukoviszidose (CF)11,12. Diese Infektionen bestehen oft aus verschiedenen mikrobiellen Arten; jedoch ist ein neuer Fokus auf die Wechselwirkungen zwischen dem Gram-positiven Bakterium Staphylococcus aureus und dem Gram-negativen Bakterium Pseudomonas aeruginosa entstanden. Studien, die mit diesen Organismen koinfiziert sind, und In-vitro-Analysen zeigen sowohl kompetitive als auch kooperative Wechselwirkungen, die tiefgreifende und unerwartete Einflüsse auf das Fortschreiten der Krankheit, das mikrobielle Überleben, die Virulenz, den Stoffwechsel und die Antibiotikaanfälligkeit haben können (im Detail von Hotterbeekx et al. 201713 und Limoli und Hoffman 20193).
Das wachsende Interesse an Wechselwirkungen zwischen Arten während der Infektion hat zu einer Vielzahl von Methoden zur Untersuchung polymikrobiellen Gemeinschaftsverhaltens geführt. Typischerweise haben diese Studien Platten- oder Brühe-basierte Assays verwendet, um die phänotypischen Unterschiede zwischen Monokultur und Kokultur zu untersuchen. Zum Beispiel hat die Kokultivierung von P. aeruginosa und S. aureus auf festen Oberflächen die Visualisierung von Wachstumshemmungen oder Veränderungen der Koloniephänotyp-, Pigment- oder Polysaccharidproduktion14,15,16ermöglicht. Gemischte Arten Biofilme, auf biotischen oder abiotischen Oberflächen, sowie die Kokultivierung von Bakterienarten in der flüssigen Kultur hat auch die Messung von Veränderungen in Wachstum, Stoffwechsel, Antibiotikatoleranz, Wettbewerb und Lebensfähigkeit ermöglicht, zusätzlich zu Gen- und Proteinexpression17,18. Während diese Massenkulturexperimente Erkenntnisse darüber gewonnen haben, wie P. aeruginosa und S. aureus sich gegenseitig auf der Community-Skala beeinflussen könnten, sind sie nicht in der Lage, wichtige Fragen über die Interaktionen zu beantworten, die auf einzelliger Ebene stattfinden. Die hier vorgestellte Methode ergänzt die Ansätze zur Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen Denspezies, indem sie sich auf die Veränderungen der Bewegung, der Zelllebensfähigkeit und der Genexpression einzelner Zellen innerhalb einer kokultivierten Gemeinschaft im Laufe der Zeit konzentriert.
Einzelzellige Interaktionen können sich stark von den Interaktionen unterscheiden, die in einer Massengemeinschaft von Zellen stattfinden. Durch Einzelzellanalyse kann die Heterogenität innerhalb einer Gemeinschaft quantifiziert werden, um zu untersuchen, wie die räumliche Platzierung von Zellen die Gemeinschaftsdynamik beeinflusst oder wie sich die Gen- und Proteinexpressionsniveaus innerhalb einzelner Mitglieder einer Gruppe verändern. Tracking-Zellen können auch einen Einblick in die Bewegung und das Verhalten einzelner Zellen im Laufe der Zeit über mehrere Generationen hinweg bieten. Durch die gleichzeitige Verfolgung der Zellbewegung und Veränderungen der Genexpression können Korrelationen zwischen Genschwankungen und entsprechenden Phänotypen hergestellt werden. Frühere Protokolle zur Untersuchung einzelner Bakterienarten auf einzelzeller Ebene wurden beschrieben. Diese Studien nutzen Live-Imaging-Zellen im Laufe der Zeit in einer einzigen Ebene und waren nützlich für die Beobachtung von Phänotypen wie Zellteilung und Antibiotikaanfälligkeit19,20. Zusätzliche Live-Imaging-Mikroskopie wurde verwendet, um Wachstum, Beweglichkeit, Oberflächenbesiedlung und Biofilmbildung einzelner Bakterienarten zu überwachen21,22,23. Während diese Studien jedoch aufschlussreich waren, um die Physiologie von Bakterien in der Monokultur zu verstehen, sind Experimente zur Beobachtung des einzelzelligen Verhaltens mehrerer Bakterienarten im Laufe der Zeit in der Kokultur begrenzt.
Hier wurden frühere Protokolle für die Bildgebung von Einzelarten angepasst, um Wechselwirkungen zwischen P. aeruginosa und S. aureuszu untersuchen. Diese Organismen können unter Phasenkontrast anhand ihrer Zellmorphologien unterschieden werden(P. aeruginosa sind Bazillen und S. aureus sind Kokzien). Die Entwicklung dieser Methode ermöglichte vor kurzem die Visualisierung von bisher unbeschriebenen Motilitätsverhalten von P. aeruginosa in Gegenwart von S. aureus24. Es wurde festgestellt, dass P. aeruginosa in der Lage war, S. aureus aus der Ferne zu erfassen und mit erhöhten und gerichteten einzelzelligen Bewegungen auf Cluster von S. aureus-Zellen zu reagieren. P. aeruginosa Bewegung in Richtung S. aureus wurde gefunden, um den Typ IV pili (TFP), haarähnliche Projektionen, deren koordinierte Verlängerung und Rückzug erzeugen eine Bewegung namens zuckende Motilität25.
Diese Studien zeigen den Nutzen dieser Methode für die Vernehmung früherer Wechselwirkungen zwischen Arten. Die Bildgebung bei hoher Zelldichte zu späteren Interaktionszeitpunkten ist jedoch schwierig, da einzelne Zellschichten nicht mehr identifiziert werden können, was bei der nach-Imaging-Analyse meist Probleme aufwirft. Angesichts dieser Einschränkung eignet sich die Methode am besten für frühere Interaktionen, die dann mit traditionellen makroskopischen Assays bei höheren Zelldichten, die für spätere Wechselwirkungen repräsentativ sind, weiterverfolgt werden könnten. Weitere Einschränkungen dieser Methode sind die geringe Durchsatz-Natur, da jeweils nur eine Probe abgebildet werden kann und die Kosten für Mikroskop, Kamera und Umweltkammer. Darüber hinaus birgt die Fluoreszenzmikroskopie Risiken für die Bakterienzellen wie Phototoxizität und Photobleaching und begrenzt somit die Häufigkeit, mit der Fluoreszenzbilder erfasst werden können. Schließlich sind die bei dieser Methode verwendeten Agarose-Pads sehr anfällig für Veränderungen in der Umgebung, was es wichtig macht, Bedingungen wie Temperatur und Luftfeuchtigkeit zu kontrollieren, da die Pads zu schrumpfen oder zu erweitern beginnen können, wenn die Bedingungen nicht korrekt sind. Schließlich, während diese Methode nicht die Wirtsumgebung imitiert, liefert sie Hinweise darauf, wie verschiedene Bakterienarten auf Oberflächen reagieren, die in Assays, die Umwelt-/Wirtsbedingungen nachahmen, weiterverfolgt werden können.
Diese Methode unterscheidet sich von früheren Studien, die die Bewegung einzelner Zellen verfolgen, indem Zellen zwischen einem Deckslip und einem Agarose-Pad geimpft werden, wodurch Zellen auf die Oberfläche beschränkt werden. Dies ermöglicht die Zellverfolgung im Laufe der Zeit in einer einzelnen Ebene. begrenzt jedoch Zyklen der transienten Oberflächeninteraktion, die beobachtet werden, wenn Zellen in Flüssigkeit26eingetaucht sind. Ein weiterer Vorteil der Bildgebung von Bakterien unter einem Agarose-Pad ist, dass es makroskopische plattenbasierte Sub-Oberflächen-Inokulations-Assays imitiert, die klassisch verwendet werden, um P. aeruginosa zuckende Motilität zu untersuchen25. In diesem Test werden Bakterienzellen zwischen dem Boden einer Petrischale und dem Agar geimpft, wodurch die Zellen in einer einzigen Ebene gehalten werden, während sie sich vom Punkt der Impfung nach außen bewegen, ähnlich wie dieses Mikroskopieprotokoll.
Das hier vorgestellte Zeitraffer-Mikroskopieprotokoll zur Visualisierung von Wechselwirkungen zwischen Spezies besteht aus 1) der Vorbereitung der Bakterienprobe und des Agarose-Pads, 2) der Auswahl von Mikroskopeinstellungen für die bildgebende Erfassung und 3) der nach-imaging-Analyse. Eine detaillierte Visualisierung der Zellbewegung und -verfolgung kann durch Erfassung von Bildern in kurzen Zeitintervallen durch Phasenkontrast erfolgen. Die Fluoreszenzmikroskopie kann auch verwendet werden, um die Zelllebensfähigkeit oder Genexpression im Laufe der Zeit zu bestimmen. Hier zeigen wir ein Beispiel für die Anpassung an die Fluoreszenzmikroskopie durch Zugabe von Lebensfähigkeitsfarbstoffen zu den Agarose-Pads.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hier vorgestellten Methoden beschreiben ein Protokoll zur Live-Zell-Bildgebung von Wechselwirkungen mit bakterienarten auf Einzelzellebene mit Modifikationen für andere Anwendungen, einschließlich Zellverfolgung und Überwachung der Zelllebensfähigkeit. Diese Methode eröffnet neue Wege für die Untersuchung des einzelzelligen Verhaltens von Mikroorganismen in der Kokultur mit anderen Arten im Laufe der Zeit. Insbesondere zeigt das Protokoll die Nützlichkeit dieser Kokulturmethode bei der Beobachtung bakterieller…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Fördermittel der Cystic Fibrosis Foundation Postdoc-to-Faculty Transition Award LIMOLI18F5 (DHL), Cystic Fibrosis Foundation Junior Faculty Recruitment Award LIMOLI19R3 (DHL) und NIH T32 Training Grant 5T32HL007638-34 (ASP) unterstützt. Wir danken Jeffrey Meisner, Minsu Kim und Ethan Garner für den Austausch von ersten Protokollen und Ratschlägen für die Bildgebung und die Herstellung von Pads.
Materials
| Agarose pads | |||
| 35 mm Glass Bottom Dish with 20 mm Micro-well #1.5 Cover Glass | Cellvis | D35-20-1.5-N | One for agarose pad molds, one for experiment |
| KimWipes | Kimberly-Clark Professional | 06-666A | |
| Low-Melt Agarose | Nu-Sieve GTG/Lonza | 50081 | For making agarose pads |
| Round-Bottom Spatulas | VWR | 82027-492 | |
| Round-Tapered Spatulas | VWR | 82027-530 | |
| Silicon Isolators, Press-to-Seal, 1 well, D diameter 2.0 mm 20 mm, silicone/adhesive | Sigma-Aldrich | S6685-25EA | For agarose pad molds |
| Sterile Petri Plates, 85 mm | Kord-Valmark /sold by RPI | 2900 | |
| Tweezers | VWR | 89259-944 | |
| M8T Minimal Media | |||
| D (+) Glucose | RPI | G32045 | |
| KH2PO4 | RPI | P250500 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 208094 | |
| NaCl | RPI | S23025 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Tryptone | BD Biosciences | DF0123173 | |
| Microscope | |||
| Andor Sona 4.2B-11 | Andor | 77026135 | Camera. 4.2 Megapixel Back-illuminated sCMOS, 11 μm pixel, 95% QE, 48 fps, USB 3.0, F-mount. |
| Filter Cube GFP | Nikon | 96372 | Filter cube |
| Filter Cube TxRed | Nikon | 96375 | Filter cube |
| H201-NIKON-TI-S-ER | Okolab | 77057447 | Stagetop incubator |
| Nikon NIS-Elements AR with GA3 and 2D and 3D tracking | Nikon | 77010609, MQS43110, 77010603, MQS42950 | Software for data analysis |
| Nikon Ti2 Eclipse | Nikon | Model Ti2-E | Microscope |
| CFI Plan Apo ƛ20x objective (0.75NA) | Nikon | MRD00205 | Objective |
| CFI Plan Apo ƛ100x oil Ph3 DM objective (1.45NA) | Nikon | MRD31905 | Objective |
| ThermoBox with built-in fan heaters | Tokai Hit | TI2TB-E-BK | Enclosure |
| Bacterial Strains | |||
| Pseudomonas aeruginosa PA14 (WT) | PMID: 7604262 | Non-mucoid prototroph | |
| Pseudomonas aeruginosa PA14 (WT) pSMC21 (Ptac-GFP) | PMID: 9361441 | ||
| Pseudomonas aeruginosa PAO1 (WT) pPrpoD-mKate2 | PMID: 26041805 | ||
| Staphylococcus aureus USA300 LAC (WT) | PMID: 23404398 | USA300 CA-Methicillin resistant strain LAC without plasmids | |
| Staphylococcus aureus USA300 LAC (WT) pCM29 (sarAP1-sGFP) | PMID: 20829608 | ||
| Staphylococcus aureus USA300 LAC △agrBDCA | PMID: 31713513 | ||
| Viability Stain | |||
| Propidium Iodide | Invitrogen | L7012 | LIVE/DEAD™ BacLight™ Bacterial Viability Kit |
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