Kinetische visualisatie van single-cell interspecies bacteriële interacties
Summary
Dit live-bacteriële celbeeldvormingsprotocol maakt visualisatie mogelijk van interacties tussen meerdere bacteriële soorten op het eencellige niveau in de tijd. Time-lapse imaging maakt het mogelijk om elke bacteriesoort in monocultuur of cocultuur te observeren om interspecies interacties te ondervragen in bacteriële gemeenschappen met meerdere soorten, waaronder individuele celmotiliteit en levensvatbaarheid.
Abstract
Polymicrobiële gemeenschappen zijn alomtegenwoordig van aard, maar het bestuderen van hun interacties op eencellig niveau is moeilijk. Zo is een op microscopie gebaseerde methode ontwikkeld voor het observeren van interspecies interacties tussen twee bacteriële pathogenen. Het gebruik van deze methode om interacties tussen een motile Gram-negatieve ziekteverwekker, Pseudomonas aeruginosa en een niet-motile Gram-positieve ziekteverwekker te ondervragen, staphylococcus aureus wordt hier aangetoond. Dit protocol bestaat uit co-inenting van elke soort tussen een coverslip en een agarose pad, die de cellen in een enkel vlak onderhoudt en zorgt voor visualisatie van bacterieel gedrag in zowel ruimte als tijd.
Bovendien is de hier aangetoonde time-lapse microscopie ideaal voor het visualiseren van de vroege interacties tussen twee of meer bacteriële soorten, waaronder veranderingen in de beweeglijkheid van bacteriële soorten in monocultuur en in cocultuur met andere soorten. Vanwege de aard van de beperkte monsterruimte in de microscopie-opstelling is dit protocol minder van toepassing voor het bestuderen van latere interacties tussen bacteriële soorten zodra de celpopulaties te hoog zijn. Echter, er zijn verschillende toepassingen van het protocol die het gebruik van kleuring voor beeldvorming levende en dode bacteriële cellen, kwantificering van gen- of eiwitexpressie door fluorescerende verslaggevers, en het bijhouden van bacteriële celbeweging in zowel enkele soorten en multispecies experimenten omvatten.
Introduction
Polymicrobiële gemeenschappen komen vaak voor in de natuur, verspreid over een verscheidenheid vanmilieu-1,2,3 en menselijke niches4,5. Enkele van de meest beruchte polymicrobiële infecties bij menselijke ziekte zijn tandheelkundige biofilms6, chronische wonden7,8, en luchtweginfecties bij personen met chronische obstructieve longziekte9, beademingsgerelateerde longontsteking10, en de genetische ziekte cystische fibrose (CF)11,12. Deze infecties bestaan vaak uit diverse microbiële soorten; echter, een recente focus op de interacties tussen de Gram-positieve bacterie Staphylococcus aureus en de Gram-negatieve bacterie Pseudomonas aeruginosa is ontstaan. Studies met inbegrip van patiënten die met deze organismen zijn besmet en in vitro-analyses onthullen zowel concurrerende als coöperatieve interacties die diepgaande en onverwachte invloeden kunnen hebben op de progressie van de ziekte, microbiële overleving, virulentie, metabolisme en antibioticagevoeligheid (in detail beoordeeld door Hotterbeekx et al. 201713 en Limoli en Hoffman 20193).
De groeiende interesse in interspecies interacties tijdens infectie heeft een verscheidenheid aan methoden opgeleverd voor het bestuderen van polymicrobiële gemeenschap gedrag. Typisch, deze studies hebben gebruikt plaat of bouillon-gebaseerde tests om de fenotypische verschillen tussen monocultuur en cocultuur te onderzoeken. Bijvoorbeeld, coculturing P. aeruginosa en S. aureus op vaste oppervlakken heeft toegestaan voor visualisatie van groeiremming of veranderingen in kolonie fenotype, pigment, of polysaccharide productie14,15,16. Gemengde soorten biofilms, op biotische of abiotische oppervlakken, evenals het coculeren van bacteriële soorten in vloeibare cultuur heeft het ook mogelijk gemaakt meting van veranderingen in groei, metabolisme, antibioticatolerantie, concurrentie en levensvatbaarheid, naast gen- en eiwitexpressie17,18. Hoewel deze bulkcultuurexperimenten inzicht hebben verwezen in hoe P. aeruginosa en S. aureus elkaar op gemeenschapsschaal zouden kunnen beïnvloeden, zijn ze niet in staat om belangrijke vragen te beantwoorden over de interacties die plaatsvinden op eencellig niveau. De hier gepresenteerde methode draagt bij aan de benaderingen voor het bestuderen van interspecies interacties door zich te concentreren op de veranderingen in beweging, cel levensvatbaarheid, en genexpressie van enkele cellen binnen een cocultured gemeenschap in de tijd.
Single-cell interacties kunnen sterk verschillen van de interacties die plaatsvinden in een bulk gemeenschap van cellen. Door middel van eencellige analyse kan heterogeniteit binnen een gemeenschap worden gekwantificeerd om te bestuderen hoe ruimtelijke plaatsing van cellen de dynamiek van de gemeenschap beïnvloedt of hoe gen- en eiwitexpressieniveaus veranderen binnen individuele leden van een groep. Het bijhouden van cellen kan ook inzicht geven in hoe afzonderlijke cellen zich in de loop van de tijd bewegen en zich gedragen, door meerdere generaties heen. Door het gelijktijdig bijhouden van celbeweging en veranderingen in genexpressie, kunnen correlaties worden gemaakt tussen genschommelingen en overeenkomstige fenotypen. Eerdere protocollen voor het bestuderen van individuele bacteriële soorten op eencellig niveau zijn beschreven. Deze studies maken gebruik van live-imaging cellen in de tijd in een enkel vlak, en zijn nuttig geweest voor het observeren van fenotypes zoals celdeling en antibiotica gevoeligheid19,20. Extra live-imaging microscopie is gebruikt om de groei, beweeglijkheid, oppervlaktekolonisatie en biofilmvorming van enkele bacteriële soorten21,22,23te monitoren . Echter, terwijl deze studies zijn inzichtelijk voor het begrijpen van de fysiologie van bacteriën in monocultuur, experimenten voor het observeren van eencellige gedrag van meerdere bacteriële soorten na verloop van tijd in cocultuur zijn beperkt.
Hier zijn eerdere protocollen die worden gebruikt voor beeldvorming met één soort aangepast om de interacties tussen P. aeruginosa en S. aureuste bestuderen. Deze organismen kunnen onder fasecontrast worden onderscheiden op basis van hun celmorfologieën(P. aeruginosa zijn bacillen en S. aureus zijn cocci). De ontwikkeling van deze methode maakte onlangs de visualisatie van eerder onbeschreven beweeglijkheidsgedrag van P. aeruginosa in aanwezigheid van S. aureus24mogelijk . P. aeruginosa bleek S. aureus van een afstand te kunnen waarmaken en te reageren met verhoogde en directionele eencellige bewegingen naar clusters van S. aureus-cellen. P. aeruginosa beweging naar S. aureus bleek het type IV pili (TFP), haar-achtige projecties waarvan de gecoördineerde uitbreiding en intrekking genereren een beweging genaamd trillende beweeglijkheid25vereisen .
Deze studies tonen het nut van deze methode voor het ondervragen van eerdere interacties tussen soorten. Beeldvorming bij hoge celdichtheden op latere interactietijdpunten is echter moeilijk, aangezien afzonderlijke lagen cellen niet meer kunnen worden geïdentificeerd, wat meestal problemen oplevert tijdens analyse na de beeldvorming. Gezien deze beperking is de methode het meest geschikt voor eerdere interacties die vervolgens kunnen worden opgevolgd met traditionele macroscopische tests bij hogere celdichtheden die representatief zijn voor latere interacties. Bijkomende beperkingen van deze methode zijn de lage doorvoer, omdat slechts één monster tegelijk kan worden afgebeeld en de kosten van de microscoop, camera en milieukamer. Bovendien vormt fluorescentiemicroscopie risico’s voor de bacteriële cellen zoals fototoxiciteit en fotobleaching, waardoor de frequentie wordt beperkt dat fluorescentiebeelden kunnen worden verkregen. Ten slotte zijn de agarosepads die bij deze methode worden gebruikt zeer gevoelig voor veranderingen in de omgeving, waardoor het van cruciaal belang is om te controleren op omstandigheden zoals temperatuur en vochtigheid, gezien het feit dat de pads kunnen beginnen te krimpen of uit te breiden als de omstandigheden niet correct zijn. Ten slotte, terwijl deze methode niet na te bootsen de gastheer omgeving, het biedt aanwijzingen voor hoe verschillende bacteriële soorten reageren op oppervlakken, die kunnen worden opgevolgd in tests ontworpen om milieu / gastheer voorwaarden na te bootsen.
Deze methode verschilt van eerdere studies bijhouden van eencellige beweging, in die zin dat cellen worden ingeënt tussen een coverslip en agarose pad, beperking van cellen aan het oppervlak. Dit maakt celtracking na verloop van tijd in één vlak mogelijk; beperkt echter cycli van tijdelijke oppervlaktebetrokkenheid waargenomen wanneer cellen worden ondergedompeld in vloeistof26. Een bijkomend voordeel van beeldvorming bacteriën onder een agarose pad is dat het bootst macroscopische plaat-gebaseerde sub-oppervlakte inenting testen klassiek gebruikt om P. aeruginosa trillende beweeglijkheid25onderzoeken . In deze test worden bacteriële cellen ingeënt tussen de bodem van een petrischaaltje en de agar, waardoor de cellen in één vlak blijven terwijl ze over de bodem van de schotel naar buiten bewegen vanaf het punt van inenting, net als dit microscopieprotocol.
De time-lapse microscopie protocol voor het visualiseren van interspecies interacties hier gepresenteerd bestaat uit 1) de voorbereiding van de bacteriële monster en agarose pad, 2) het selecteren van microscoop instellingen voor imaging acquisitie en 3) post-imaging analyse. Gedetailleerde visualisatie van celbeweging en tracking kan worden uitgevoerd door het verwerven van beelden op korte tijdsintervallen op fasecontrast. Fluorescentie microscopie kan ook worden gebruikt om cel levensvatbaarheid of genexpressie te bepalen na verloop van tijd. Hier tonen we een voorbeeld van aanpassing voor fluorescentie microscopie door de toevoeging van levensvatbaarheid kleurstoffen aan de agarose pads.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier gepresenteerde methoden beschrijven een protocol voor live-cel beeldvorming van bacteriële soorten interacties op het niveau van eencellige met wijzigingen voor andere toepassingen, waaronder celtracking en monitoring van de levensvatbaarheid van cellen. Deze methode opent nieuwe wegen voor het bestuderen van eencellig gedrag van micro-organismen in cocultuur met andere soorten in de tijd. Specifiek, het protocol toont het nut van deze cocultuur methode in het observeren van bacteriële oppervlakte gedrag, met n…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door financiering van de Cystic Fibrosis Foundation Postdoc-to-Faculty Transition Award LIMOLI18F5 (DHL), Cystic Fibrosis Foundation Junior Faculty Recruitment Award LIMOLI19R3 (DHL) en NIH T32 Training Grant 5T32HL007638-34 (ASP). Wij danken Jeffrey Meisner, Minsu Kim, en Ethan Garner voor het delen van de eerste protocollen en advies voor beeldvorming en het maken van pads.
Materials
| Agarose pads | |||
| 35 mm Glass Bottom Dish with 20 mm Micro-well #1.5 Cover Glass | Cellvis | D35-20-1.5-N | One for agarose pad molds, one for experiment |
| KimWipes | Kimberly-Clark Professional | 06-666A | |
| Low-Melt Agarose | Nu-Sieve GTG/Lonza | 50081 | For making agarose pads |
| Round-Bottom Spatulas | VWR | 82027-492 | |
| Round-Tapered Spatulas | VWR | 82027-530 | |
| Silicon Isolators, Press-to-Seal, 1 well, D diameter 2.0 mm 20 mm, silicone/adhesive | Sigma-Aldrich | S6685-25EA | For agarose pad molds |
| Sterile Petri Plates, 85 mm | Kord-Valmark /sold by RPI | 2900 | |
| Tweezers | VWR | 89259-944 | |
| M8T Minimal Media | |||
| D (+) Glucose | RPI | G32045 | |
| KH2PO4 | RPI | P250500 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 208094 | |
| NaCl | RPI | S23025 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Tryptone | BD Biosciences | DF0123173 | |
| Microscope | |||
| Andor Sona 4.2B-11 | Andor | 77026135 | Camera. 4.2 Megapixel Back-illuminated sCMOS, 11 μm pixel, 95% QE, 48 fps, USB 3.0, F-mount. |
| Filter Cube GFP | Nikon | 96372 | Filter cube |
| Filter Cube TxRed | Nikon | 96375 | Filter cube |
| H201-NIKON-TI-S-ER | Okolab | 77057447 | Stagetop incubator |
| Nikon NIS-Elements AR with GA3 and 2D and 3D tracking | Nikon | 77010609, MQS43110, 77010603, MQS42950 | Software for data analysis |
| Nikon Ti2 Eclipse | Nikon | Model Ti2-E | Microscope |
| CFI Plan Apo ƛ20x objective (0.75NA) | Nikon | MRD00205 | Objective |
| CFI Plan Apo ƛ100x oil Ph3 DM objective (1.45NA) | Nikon | MRD31905 | Objective |
| ThermoBox with built-in fan heaters | Tokai Hit | TI2TB-E-BK | Enclosure |
| Bacterial Strains | |||
| Pseudomonas aeruginosa PA14 (WT) | PMID: 7604262 | Non-mucoid prototroph | |
| Pseudomonas aeruginosa PA14 (WT) pSMC21 (Ptac-GFP) | PMID: 9361441 | ||
| Pseudomonas aeruginosa PAO1 (WT) pPrpoD-mKate2 | PMID: 26041805 | ||
| Staphylococcus aureus USA300 LAC (WT) | PMID: 23404398 | USA300 CA-Methicillin resistant strain LAC without plasmids | |
| Staphylococcus aureus USA300 LAC (WT) pCM29 (sarAP1-sGFP) | PMID: 20829608 | ||
| Staphylococcus aureus USA300 LAC △agrBDCA | PMID: 31713513 | ||
| Viability Stain | |||
| Propidium Iodide | Invitrogen | L7012 | LIVE/DEAD™ BacLight™ Bacterial Viability Kit |
References
- Lamichhane, J. R., Venturi, V. Synergisms between microbial pathogens in plant disease complexes: a growing trend. Frontiers in Plant Science. 6, 385 (2015).
- Cursino, L., et al. Identification of an operon, Pil-Chp, that controls twitching motility and virulence in Xylella fastidiosa. Molecular Plant-Microbe Interactions. 24 (10), 1198-1206 (2011).
- Limoli, D. H., Hoffman, L. R. Help, hinder, hide and harm: what can we learn from the interactions between Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus during respiratory infections. Thorax. 74, 684-692 (2019).
- Gabrilska, R. A., Rumbaugh, K. P. Biofilm models of polymicrobial infection. Future Microbiology. 10 (12), 1997-2015 (2015).
- Nobile, C. J., Mitchell, A. P. Microbial biofilms: e pluribus unum. Current Biology. 17 (10), 349-353 (2007).
- Marino, P. J., et al. Community analysis of dental plaque and endotracheal tube biofilms from mechanically ventilated patients. Journal of Critical Care. 39, 149-155 (2017).
- Frank, D. N., et al. Microbial diversity in chronic open wounds. Wound Repair and Regeneration. 17, 163-172 (2009).
- Fazli, M., et al. Nonrandom distribution of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus in chronic wounds. Journal of Clinical Microbiology. 47 (12), 4084-4089 (2009).
- Shimizu, K., et al. Pathogens in COPD exacerbations identified by comprehensive real-time PCR plus older methods. International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease. 10, 2009-2016 (2015).
- Behnia, M., Logan, S. C., Fallen, L., Catalano, P. Nosocomial and ventilator-associated pneumonia in a community hospital intensive care unit: a retrospective review and analysis. BMC Research Notes. 7, 232 (2014).
- Maliniak, M. L., Stecenko, A. A., McCarty, N. A. A longitudinal analysis of chronic MRSA and Pseudomonas aeruginosa co-infection in cystic fibrosis: a single-center study. Journal of Cystic Fibrosis. 15 (3), 350-356 (2016).
- Limoli, D. H., et al. Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa co-infection is associated with cystic fibrosis-related diabetes and poor clinical outcomes. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 35 (6), 947-953 (2016).
- Hotterbeekx, A., Kumar-Singh, S., Goossens, H., Malhotra-Kumar, S. In vivo and in vitro interactions between Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus spp. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7 (106), (2017).
- Smith, K., et al. Aspergillus fumigatus enhances elastase production in Pseudomonas aeruginosa co-cultures. Medical Mycology. 53, 645-655 (2015).
- Michelson, C. F., et al. Staphylococcus aureus alters growth activity, autolysis, and antibiotic tolerance in a human host-adapted Pseudomonas aeruginosa lineage. Journal of Bacteriology. 196 (22), 3903-3911 (2014).
- Ngamdee, W., et al. Competition between Burkholderia pseudomallei and B. thailandensis. BMC Microbiology. 15, 56 (2015).
- Heir, E., Møretrø, T., Simessen, A., Langsrud, S. Listeria monocytogenes strains show larger variations in competitive growth in mixed culture biofilms and suspensions with bacteria from food processing environments. International Journal of Food Microbiology. 275, 46-55 (2018).
- Lutz, C., Thomas, T., Steinberg, P., Kjelleberg, S., Egan, S. Effect of interspecific competition on trait variation in Phaeobacter inhibens biofilms. Environmental Microbiology. 18 (5), 1635-1645 (2016).
- Meisner, J., et al. FtsEX is required for CwlO peptidoglycan hydrolase activity during cell wall elongation in Bacillus subtilis. Molecular Microbiology. 89 (6), 1069-1083 (2013).
- Coates, J., et al. Antibiotic-induced population fluctuations and stochastic clearance of bacteria. eLife. 7, 32976 (2018).
- Korber, D. R., Lawrence, J. R., Sutton, B., Caldwell, D. E. Effect of laminar flow velocity on the kinetics of surface recolonization by Mot+ and Mot- Pseudomonas fluorescens. Microbial Ecology. 18, 1-19 (1989).
- Lawrence, J. R., Korber, D. R., Caldwell, D. E. Behavioral analysis of Vibrio parahaemolyticus variants in high- and low- viscosity microenvironments by use of digital image processing. Journal of Bacteriology. 174 (17), 5732-5739 (1992).
- Lawrence, J. R., Wolfaardt, G. M., Korber, D. R. Determination of diffusion coefficients in biofilms by confocal laser microscopy. Applied and Environmental Microbiology. 60 (4), 1166-1173 (1994).
- Limoli, D. H., et al. Interspecies interactions induce exploratory motility in Pseudomonas aeruginosa. eLife. 8, 47365 (2019).
- Burrows, L. Pseudomonas aeruginosa twitching motility: type IV pili in action. Annual Review of Microbiology. 66 (1), 493-520 (2012).
- Lee, C. K., et al. Multigenerational memory and adaptive adhesion in early bacterial biofilm communities. PNAS. 115 (17), 4471-4476 (2018).
- Tolosa, A., et al. Enhanced field-of-view integral imaging display using multi-Köhler illumination. Optical Society of America. 22 (26), 31853-31863 (2014).
