Caracterización de células inmunes y mediadores proinflamatorios en el ambiente pulmonar
Summary
Este protocolo describe el uso de la citometría de flujo para identificar los cambios en la composición de las células inmunitarias, el perfil de citoquinas y el perfil de quimiocinas en el entorno pulmonar después de la oclusión transitoria de la arteria cerebral media, un modelo murino de accidente cerebrovascular isquémico.
Abstract
La expansión, activación y tráfico de células inmunes a los pulmones, que están controlados por la expresión de múltiples citoquinas y quimiocinas, pueden verse alterados por una lesión cerebral grave. Esto se evidencia por el hecho de que la neumonía es una causa importante de mortalidad en pacientes que han sufrido un accidente cerebrovascular isquémico. El objetivo de este protocolo es describir el uso del análisis citométrico de flujo multicolor para identificar 13 tipos de células inmunes en los pulmones de ratones, incluidos macrófagos alveolares, macrófagos intersticiales, células dendríticas (DC) CD103 + o CD11b +, CD plasmocitoides, eosinófilos, monocitos / células derivadas de monocitos, neutrófilos, células T y B derivadas de linfoides, células NK y células NKT, después de la inducción isquémica de accidente cerebrovascular por oclusión transitoria de la arteria cerebral media. Además, describimos la preparación de homogeneizados pulmonares utilizando un método de homogeneización de perlas, para determinar los niveles de expresión de 13 citoquinas o quimiocinas diferentes simultáneamente mediante matrices de perlas multiplex junto con análisis citométrico de flujo. Este protocolo también se puede utilizar para investigar la respuesta inmune pulmonar en otros entornos de enfermedades, como la enfermedad pulmonar infecciosa o la enfermedad alérgica.
Introduction
Los pulmones son un órgano barrera, expuestos al ambiente externo y, por lo tanto, están constantemente recibiendo desafíos inmunológicos como patógenos y alérgenos1. La activación de las células inmunes residentes en los pulmones y la infiltración de células inmunes de la periferia son necesarias para eliminar los patógenos del entorno pulmonar. Además, las células inmunes residentes en los pulmones mantienen la tolerancia a las bacterias comensales, lo que sugiere que estas células desempeñan un papel en la eliminación de patógenos y en el mantenimiento de la homeostasis1. Los macrófagos alveolares e intersticiales se encuentran entre las células inmunes centinela residentes en los pulmones que detectan patógenos a través de receptores de reconocimiento de patrones y eliminan estos patógenos por fagocitosis2. Las células dendríticas residentes en los pulmones unen la respuesta inmune innata y adaptativa a través de la presentación del antígeno3. Además, las células inmunes innatas locales activadas producen citoquinas y quimiocinas que amplifican la respuesta inflamatoria y estimulan la infiltración de células inmunes como monocitos, neutrófilos y linfocitos en los pulmones1. Se ha demostrado que el accidente cerebrovascular isquémico modifica la inmunidad sistémica y conduce a una mayor susceptibilidad a la infección pulmonar; Sin embargo, pocos estudios han evaluado el compartimento pulmonar después del accidente cerebrovascular isquémico, aunque algunos estudios lo han examinado durante condiciones inflamatorias 4,5,6,7,8,9. El objetivo de los métodos descritos en este documento es determinar simultáneamente la patología pulmonar, la composición de las células inmunes y los niveles de expresión de citoquinas y quimiocinas en los pulmones para evaluar las alteraciones en el compartimiento pulmonar y evaluar las posibles alteraciones en la respuesta inmune pulmonar después del ataque isquémico.
Aquí se describe un protocolo para obtener suspensiones de células individuales de los pulmones de los ratones para identificar 13 tipos de células inmunes. Este protocolo se basa en la digestión de tejidos con colagenasa D sin necesidad de un disociador tisular automatizado. Además, desarrollamos un protocolo para preparar homogeneizados tisulares que se pueden usar para determinar los niveles de expresión de 13 citoquinas o quimiocinas diferentes utilizando matrices de perlas multiplex basadas en citometría de flujo. Este protocolo se utilizó con éxito para investigar los efectos del accidente cerebrovascular isquémico en la inmunidad pulmonar y también se puede utilizar en otros modelos de enfermedad.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los protocolos descritos aquí permiten la identificación de tipos de células inmunes pulmonares y la expresión de quimiocinas o citoquinas en el mismo ratón. Si se desea un estudio histopatológico, se puede extraer y fijar un lóbulo individual para ese propósito antes de proceder a los pasos de aislamiento de células individuales. Una limitación de este método es que este enfoque puede no ser adecuado en algunos entornos de enfermedad si se prevé que el cambio en la composición de las células inmunes y la e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la subvención P20 GM109098 de los NIH y el Programa de Premios a la Innovación de Praespero a Edwin Wan. Los experimentos de citometría de flujo se realizaron en la WVU Flow Cytometry & Single Cell Core Facility, que cuenta con el apoyo de las subvenciones de los NIH S10 OD016165, U57 GM104942, P30 GM103488 y P20 GM103434.
Materials
| B220-APC, clone RA3-6B2 | Biolegend | 103212 | 1:200 dilution |
| Beadbug 3 position bead homogenizer | Benchmark Scientific | D1030 | Tissue homogenizer |
| CCR2-BV421, clone SA203G11 | Biolegend | 150605 | 1:200 dilution |
| CD103-BV421, clone 2E7 | Biolegend | 121422 | 1:200 dilution |
| CD11b-PE/Cy7, clone M1/70 | Biolegend | 101216 | 1:400 dilution |
| CD11c-PE/Cy7, clone N418 | Biolegend | 117318 | 1:200 dilution |
| CD11c-Percp/Cy5.5, clone N418 | Biolegend | 117328 | 1:200 dilution |
| CD4-BV421, clone GK1.5 | Biolegend | 100443 | 1:200 dilution |
| CD45-FITC, clone 30-F11 | Biolegend | 103108 | 1:200 dilution |
| CD64-APC, clone X54-5/7.1 | Biolegend | 139306 | 1:200 dilution |
| CD8-PE, clone 53-6.7 | Biolegend | 100708 | 1:800 dilution |
| Collagenase D | Sigma Aldrich | 11088882001 | Component in the dissociation buffer |
| Conical screw cap tube | ThermoFisher | 02-681-344 | Tube for tissue homogenization |
| DNase I | Sigma Aldrich | 10104159001 | Component in the dissociation buffer |
| Fc block CD16/32 antibody | Biolegend | 101320 | 1:100 dilution |
| genlteMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Comparsion of lung digestion with or without mechanical dissociator |
| gentleMACS C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | Tube for tissue disscoiation with genlteMACS dissociator |
| Halt protease and phosphatase inhibitor cocktial | ThermoFisher | 78442 | Component in the homogenization buffer |
| Laser doppler monitor | Moor | MOORVMS-LDF | Blood flow monitoring during tMCAO |
| LEGENDplex proinflammatory chemokine panel | Biolegend | 740451 | Multiplex bead array |
| LIVE/DEAD fixable near-IR stain | ThermoFisher | L34976 | Use for dead cell exclusion during flow cytometric analysis |
| Ly6C-PE, clone HK1.4 | Biolegend | 128008 | 1:800 dilution |
| Ly6G-BV510, clone 1A8 | Biolegend | 127633 | 1:200 dilution |
| MCAO suture L56 reusable 6-0 medium | Doccol | 602356PK10Re | tMCAO |
| MHC II-BV510, clone M5/114.15.2 | Biolegend | 107636 | 1:800 dilution |
| NK1.1-Percp/Cy5.5, clone PK136 | Biolegend | 108728 | 1:200 dilution |
| Siglec F-PE, clone E50-2440 | BD Biosciences | 552126 | 1:200 dilution |
| Silk suture thread, size 6/0 | Fine Science Tools | 18020-60 | tMCAO |
| SomnoSuite anesthesia system | Kent Scientific | SS-01 | Mouse anaesthetization for tMCAO |
| TCRb-BV510, clone H57-897 | Biolegend | 109234 | 1:200 dilution |
| Zirconia/silica beads, 2.3 mm | Biospec | 11079125z | Beads for tissue homogenization |
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