Summary

Caractérisation des cellules immunitaires et des médiateurs pro-inflammatoires en milieu pulmonaire

Published: June 24, 2020
doi:

Summary

Ce protocole décrit l’utilisation de la cytométrie en flux pour identifier les changements dans la composition des cellules immunitaires, le profil des cytokines et le profil de chimiokine dans l’environnement pulmonaire après une occlusion transitoire de l’artère cérébrale moyenne, un modèle murin d’AVC ischémique.

Abstract

L’expansion, l’activation et le trafic des cellules immunitaires vers les poumons, qui sont contrôlés par l’expression de cytokines et de chimiokines multiples, peuvent être altérés par une lésion cérébrale grave. Ceci est démontré par le fait que la pneumonie est une cause majeure de mortalité chez les patients qui ont souffert d’un AVC ischémique. L’objectif de ce protocole est de décrire l’utilisation de l’analyse cytométrique en flux multicolore pour identifier 13 types de cellules immunitaires dans les poumons de souris, y compris les macrophages alvéolaires, les macrophages interstitiels, les cellules dendritiques (DC) CD103+ ou CD11b+, les DC plasmacytoïdes, les éosinophiles, les monocytes / cellules dérivées de monocytes , les neutrophiles, les cellules T et B dérivées de lymphoïdes, les cellules NK et les cellules NKT, après induction d’un AVC ischémique par occlusion transitoire de l’artère cérébrale moyenne. De plus, nous décrivons la préparation d’homogénats pulmonaires à l’aide d’une méthode d’homogénéisation des billes, afin de déterminer les niveaux d’expression de 13 cytokines ou chimiokines différentes simultanément par des réseaux de billes multiplex couplées à une analyse cytométrique en flux. Ce protocole peut également être utilisé pour étudier la réponse immunitaire pulmonaire dans d’autres contextes pathologiques, tels que les maladies pulmonaires infectieuses ou les maladies allergiques.

Introduction

Les poumons sont un organe barrière, exposés à l’environnement extérieur et, par conséquent, subissent constamment des défis immunologiques tels que des agents pathogènes et des allergènes1. L’activation des cellules immunitaires résidentes des poumons et l’infiltration des cellules immunitaires de la périphérie sont nécessaires pour éliminer les agents pathogènes de l’environnement pulmonaire. De plus, les cellules immunitaires résidentes des poumons maintiennent une tolérance aux bactéries commensales, ce qui suggère que ces cellules jouent un rôle dans l’élimination des agents pathogènes et le maintien de l’homéostasie1. Les macrophages alvéolaires et interstitiels font partie des cellules immunitaires sentinelles résidentes des poumons qui détectent les agents pathogènes via les récepteurs de reconnaissance des formes et éliminent ces agents pathogènes par phagocytose2. Les cellules dendritiques résidentes des poumons comblent la réponse immunitaire innée et adaptative par la présentation de l’antigène3. De plus, les cellules immunitaires innées locales activées produisent des cytokines et des chimiokines qui amplifient la réponse inflammatoire et stimulent l’infiltration de cellules immunitaires telles que les monocytes, les neutrophiles et les lymphocytes dans les poumons1. Il a été démontré que l’AVC ischémique modifie l’immunité systémique et entraîne une susceptibilité accrue à l’infection pulmonaire; Cependant, peu d’études ont évalué le compartiment pulmonaire à la suite d’un AVC ischémique, bien que certaines études l’aient examiné lors de conditions inflammatoires 4,5,6,7,8,9. L’objectif des méthodes décrites ici est de déterminer simultanément la pathologie pulmonaire, la composition des cellules immunitaires et les niveaux d’expression des cytokines et des chimiokines dans les poumons afin d’évaluer les altérations du compartiment pulmonaire et d’évaluer les altérations potentielles de la réponse immunitaire pulmonaire à la suite d’un accident ischémique.

Décrit ici est un protocole pour obtenir des suspensions unicellulaires des poumons des souris pour identifier 13 types de cellules immunitaires. Ce protocole est basé sur la digestion tissulaire avec la collagénase D sans avoir besoin d’un dissociateur tissulaire automatisé. De plus, nous avons développé un protocole pour préparer des homogénats tissulaires qui peuvent être utilisés pour déterminer les niveaux d’expression de 13 cytokines ou chimiokines différentes à l’aide de réseaux de billes multiplex basés sur la cytométrie en flux. Ce protocole a été utilisé avec succès pour étudier les effets de l’AVC ischémique sur l’immunité pulmonaire et peut également être utilisé dans d’autres modèles de maladies.

Protocol

Tous les protocoles et procédures effectués ont été approuvés par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université de Virginie-Occidentale. Les souris ont été logées dans des conditions exemptes d’agents pathogènes spécifiques dans le vivarium de l’Université de Virginie-Occidentale. 1. Préparation des solutions Préparer un tampon de perfusion (solution saline tamponnée au phosphate, PBS). Utilisez environ deux aliquotes de…

Representative Results

Nous avons récemment rapporté que l’induction d’un AVC ischémique chez la souris modifie la composition des cellules immunitaires des poumons11. Plus précisément, l’ischémie cérébrale transitoire a augmenté les pourcentages de macrophages alvéolaires, de neutrophiles et de DC CD11b +, tout en diminuant les pourcentages de cellules T CD4+, de cellules T CD8+, de cellules B, de cellules NK et d’éosinophiles dans le compartiment pulmonaire. De plus, l’altération cellulaire corre…

Discussion

Les protocoles décrits ici permettent l’identification des types de cellules immunitaires pulmonaires et l’expression de chimiokines ou de cytokines chez la même souris. Si une étude histopathologique est souhaitée, un lobe individuel peut être enlevé et fixé à cette fin avant de procéder aux étapes d’isolement de la cellule unique. L’une des limites de cette méthode est que cette approche peut ne pas convenir à certains contextes de maladie si l’on s’attend à ce que le changement dans la composi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par la subvention P20 GM109098 des NIH et le programme Innovation Award de Praespero à Edwin Wan. Des expériences de cytométrie en flux ont été réalisées dans le WVU Flow Cytometry & Single Cell Core Facility, qui est soutenu par les subventions NIH S10 OD016165, U57 GM104942, P30 GM103488 et P20 GM103434.

Materials

B220-APC, clone RA3-6B2 Biolegend 103212 1:200 dilution
Beadbug 3 position bead homogenizer Benchmark Scientific D1030 Tissue homogenizer
CCR2-BV421, clone SA203G11 Biolegend 150605 1:200 dilution
CD103-BV421, clone 2E7 Biolegend 121422 1:200 dilution
CD11b-PE/Cy7, clone M1/70 Biolegend 101216 1:400 dilution
CD11c-PE/Cy7, clone N418 Biolegend 117318 1:200 dilution
CD11c-Percp/Cy5.5, clone N418 Biolegend 117328 1:200 dilution
CD4-BV421, clone GK1.5 Biolegend 100443 1:200 dilution
CD45-FITC, clone 30-F11 Biolegend 103108 1:200 dilution
CD64-APC, clone X54-5/7.1 Biolegend 139306 1:200 dilution
CD8-PE, clone 53-6.7 Biolegend 100708 1:800 dilution
Collagenase D Sigma Aldrich 11088882001 Component in the dissociation buffer
Conical screw cap tube ThermoFisher 02-681-344 Tube for tissue homogenization
DNase I Sigma Aldrich 10104159001 Component in the dissociation buffer
Fc block CD16/32 antibody Biolegend 101320 1:100 dilution
genlteMACS dissociator Miltenyi Biotec 130-093-235 Comparsion of lung digestion with or without mechanical dissociator
gentleMACS C tubes Miltenyi Biotec 130-093-237 Tube for tissue disscoiation with genlteMACS dissociator
Halt protease and phosphatase inhibitor cocktial ThermoFisher 78442 Component in the homogenization buffer
Laser doppler monitor Moor MOORVMS-LDF Blood flow monitoring during tMCAO
LEGENDplex proinflammatory chemokine panel Biolegend 740451 Multiplex bead array
LIVE/DEAD fixable near-IR stain ThermoFisher L34976 Use for dead cell exclusion during flow cytometric analysis
Ly6C-PE, clone HK1.4 Biolegend 128008 1:800 dilution
Ly6G-BV510, clone 1A8 Biolegend 127633 1:200 dilution
MCAO suture L56 reusable 6-0 medium Doccol 602356PK10Re tMCAO
MHC II-BV510, clone M5/114.15.2 Biolegend 107636 1:800 dilution
NK1.1-Percp/Cy5.5, clone PK136 Biolegend 108728 1:200 dilution
Siglec F-PE, clone E50-2440 BD Biosciences 552126 1:200 dilution
Silk suture thread, size 6/0 Fine Science Tools 18020-60 tMCAO
SomnoSuite anesthesia system Kent Scientific SS-01 Mouse anaesthetization for tMCAO
TCRb-BV510, clone H57-897 Biolegend 109234 1:200 dilution
Zirconia/silica beads, 2.3 mm Biospec 11079125z Beads for tissue homogenization

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Cite This Article
Monaghan, K. L., Farris, B. Y., Zheng, W., Wan, E. C. K. Characterization of Immune Cells and Proinflammatory Mediators in the Pulmonary Environment. J. Vis. Exp. (160), e61359, doi:10.3791/61359 (2020).

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