폐 환경에서 면역 세포 및 전염증성 중재자의 특성화
Summary
이 프로토콜은 허혈성 뇌졸중의 뮤린 모델인 일시적 중간 대뇌동맥 폐색 후 폐 환경에서 면역 세포 조성, 사이토카인 프로파일, 및 케모카인 프로파일의 변화를 확인하기 위한 유세포 분석기의 사용을 기술한다.
Abstract
면역 세포 확장, 활성화 및 여러 사이토카인 및 케모카인의 발현에 의해 조절되는 폐로의 밀매는 심각한 뇌 손상에 의해 변경될 수 있다. 이것은 폐렴이 허혈성 뇌졸중으로 고통받는 환자의 주요 사망 원인이라는 사실에 의해 입증됩니다. 이 프로토콜의 목표는 폐포 대식세포, 간질성 대식세포, CD103+ 또는 CD11b+ 수지상 세포(DCs), 혈장 세포질 DCs, 호산구, 단핵구/단핵구 유래 세포, 호중구, 림프구 유래 T 및 B 세포, NK 세포 및 NKT 세포를 포함한 마우스의 폐에서 13가지 유형의 면역 세포를 확인하기 위해 다색 유세포 분석의 사용을 설명하는 것이며, 일시적인 중간 대뇌 동맥 폐색에 의한 허혈성 뇌졸중 유도에 이른다. 더욱이, 우리는 비드 균질화 방법을 사용하여 폐 균질액의 제조를 기술하고, 유세포 분석과 결합된 멀티플렉스 비드 어레이에 의해 동시에 13개의 상이한 사이토카인 또는 케모카인의 발현 수준을 결정한다. 이 프로토콜은 또한 감염성 폐 질환 또는 알레르기성 질환과 같은 다른 질병 설정에서 폐 면역 반응을 조사하는데 사용될 수 있다.
Introduction
폐는 외부 환경에 노출되는 장벽 기관이므로 병원균 및 알레르겐1과 같은 면역 학적 도전을 끊임없이 받고 있습니다. 폐 거주 면역 세포의 활성화와 주변부에서 면역 세포의 침윤은 폐 환경에서 병원균을 제거해야합니다. 또한, 폐에 거주하는 면역 세포는 공생 박테리아에 대한 내성을 유지하며, 이는 이들 세포가 병원균 제거 및 항상성 유지에 중요한 역할을한다는 것을 암시합니다1. 폐포 및 간질성 대식세포는 패턴 인식 수용체를 통해 병원체를 감지하고 식균작용에 의해 이러한 병원체를 제거하는 폐 상주 감시자 면역 세포 중하나입니다 2. 폐-상주 수지상 세포는 항원 제시3을 통해 선천적 및 적응성 면역 반응을 연결한다. 또한, 활성화된 국소 선천적 면역 세포는 염증 반응을 증폭시키고 단핵구, 호중구 및 림프구와 같은 면역 세포의 폐로의 침윤을 자극하는 사이토카인 및 케모카인을 생성한다1. 허혈성 뇌졸중은 전신 면역을 변형시키고 폐 감염에 대한 감수성을 증가시키는 것으로 나타났습니다. 그러나 허혈성 뇌졸중 후 폐 구획을 평가 한 연구는 거의 없지만 일부 연구는 염증 상태 4,5,6,7,8,9 동안이를 조사했습니다. 본원에 기재된 방법의 목표는 폐 병리, 면역 세포 조성물, 폐에서의 사이토카인 및 케모카인 발현의 수준을 동시에 결정하여 폐 구획에 대한 변경을 평가하고 허혈성 발작 후 폐 면역 반응에 대한 잠재적 변화를 평가하는 것이다.
여기에 기재된 것은 13가지 유형의 면역 세포를 확인하기 위해 마우스의 폐로부터 단일 세포 현탁액을 수득하기 위한 프로토콜이다. 이 프로토콜은 자동화된 조직 해리제가 필요 없이 콜라게나제 D를 사용한 조직 소화를 기반으로 합니다. 추가적으로, 우리는 유세포 분석기 기반 멀티플렉스 비드 어레이를 사용하여 13개의 상이한 사이토카인 또는 케모카인의 발현 수준을 결정하는데 사용될 수 있는 조직 균질물을 제조하기 위한 프로토콜을 개발하였다. 이 프로토콜은 허혈성 뇌졸중이 폐 면역에 미치는 영향을 조사하는 데 성공적으로 사용되었으며 다른 질병 모델에서도 사용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 기술된 프로토콜은 폐 면역 세포 유형의 확인 및 동일한 마우스에서 케모카인 또는 사이토카인의 발현을 허용한다. 조직병리학 연구가 바람직한 경우, 단일 세포 분리 단계로 진행하기 전에 개별 엽을 제거하고 그 목적을 위해 고정시킬 수 있다. 이 방법의 한 가지 한계는 면역 세포 조성의 변화와 케모카인 및/또는 사이토카인의 발현이 폐의 상이한 엽 사이에 불평등하게 분포될 것으로 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 NIH 보조금 P20 GM109098과 Praespero에서 Edwin Wan까지의 혁신 상 프로그램에 의해 지원되었습니다. 유세포 측정 실험은 NIH grants S10 OD016165, U57 GM104942, P30 GM103488 및 P20 GM103434에 의해 지원되는 WVU Flow Cytometry & Single Cell Core Facility에서 수행되었습니다.
Materials
| B220-APC, clone RA3-6B2 | Biolegend | 103212 | 1:200 dilution |
| Beadbug 3 position bead homogenizer | Benchmark Scientific | D1030 | Tissue homogenizer |
| CCR2-BV421, clone SA203G11 | Biolegend | 150605 | 1:200 dilution |
| CD103-BV421, clone 2E7 | Biolegend | 121422 | 1:200 dilution |
| CD11b-PE/Cy7, clone M1/70 | Biolegend | 101216 | 1:400 dilution |
| CD11c-PE/Cy7, clone N418 | Biolegend | 117318 | 1:200 dilution |
| CD11c-Percp/Cy5.5, clone N418 | Biolegend | 117328 | 1:200 dilution |
| CD4-BV421, clone GK1.5 | Biolegend | 100443 | 1:200 dilution |
| CD45-FITC, clone 30-F11 | Biolegend | 103108 | 1:200 dilution |
| CD64-APC, clone X54-5/7.1 | Biolegend | 139306 | 1:200 dilution |
| CD8-PE, clone 53-6.7 | Biolegend | 100708 | 1:800 dilution |
| Collagenase D | Sigma Aldrich | 11088882001 | Component in the dissociation buffer |
| Conical screw cap tube | ThermoFisher | 02-681-344 | Tube for tissue homogenization |
| DNase I | Sigma Aldrich | 10104159001 | Component in the dissociation buffer |
| Fc block CD16/32 antibody | Biolegend | 101320 | 1:100 dilution |
| genlteMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Comparsion of lung digestion with or without mechanical dissociator |
| gentleMACS C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | Tube for tissue disscoiation with genlteMACS dissociator |
| Halt protease and phosphatase inhibitor cocktial | ThermoFisher | 78442 | Component in the homogenization buffer |
| Laser doppler monitor | Moor | MOORVMS-LDF | Blood flow monitoring during tMCAO |
| LEGENDplex proinflammatory chemokine panel | Biolegend | 740451 | Multiplex bead array |
| LIVE/DEAD fixable near-IR stain | ThermoFisher | L34976 | Use for dead cell exclusion during flow cytometric analysis |
| Ly6C-PE, clone HK1.4 | Biolegend | 128008 | 1:800 dilution |
| Ly6G-BV510, clone 1A8 | Biolegend | 127633 | 1:200 dilution |
| MCAO suture L56 reusable 6-0 medium | Doccol | 602356PK10Re | tMCAO |
| MHC II-BV510, clone M5/114.15.2 | Biolegend | 107636 | 1:800 dilution |
| NK1.1-Percp/Cy5.5, clone PK136 | Biolegend | 108728 | 1:200 dilution |
| Siglec F-PE, clone E50-2440 | BD Biosciences | 552126 | 1:200 dilution |
| Silk suture thread, size 6/0 | Fine Science Tools | 18020-60 | tMCAO |
| SomnoSuite anesthesia system | Kent Scientific | SS-01 | Mouse anaesthetization for tMCAO |
| TCRb-BV510, clone H57-897 | Biolegend | 109234 | 1:200 dilution |
| Zirconia/silica beads, 2.3 mm | Biospec | 11079125z | Beads for tissue homogenization |
References
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