Um ensaio automatizado de coloração nuclear diferencial para determinação precisa da citotoxicidade mitocana
Summary
O protocolo descreve um ensaio rápido, de alto rendimento, confiável, barato e imparcial para determinar eficientemente a viabilidade celular. Este ensaio é particularmente útil quando as mitocôndrias das células foram danificadas, o que interfere com outros ensaios. O ensaio utiliza a contagem automatizada de células manchadas com dois corantes nucleares – Hoechst 33342 e iodeto de propidium.
Abstract
A contribuição das mitocôndrias para a transformação oncogênica é um assunto de amplo interesse e estudo ativo. À medida que o campo do metabolismo do câncer se torna mais complexo, o objetivo de atingir mitocôndrias usando vários compostos que infligem danos mitocondriais (os chamados mitocanos) está se tornando bastante popular. Infelizmente, muitos ensaios de citotoxicidade existentes, como aqueles baseados em sais de tetrazolium ou resazurina, requerem enzimas mitocondriais funcionais para seu desempenho. O dano infligido por compostos que atingem mitocôndrias muitas vezes compromete a precisão desses ensaios. Aqui, descrevemos um protocolo modificado baseado em coloração diferencial com dois corantes fluorescentes, um deles é permeante celular (Hoechst 33342) e o outro não é (iodeto de propidium). A diferença na coloração permite que células vivas e mortas sejam discriminadas. O ensaio é amenável à microscopia automatizada e à análise de imagens, o que aumenta o throughput e reduz o viés. Isso também permite que o ensaio seja usado de forma de alta produtividade usando placas de 96 poços, tornando-se uma opção viável para os esforços de descoberta de drogas, particularmente quando as drogas em questão têm algum nível de mitotoxicidade. É importante ressaltar que os resultados obtidos pelo ensaio de coloração de Hoechst/PI mostram maior consistência, tanto com resultados de exclusão azul trypan quanto entre réplicas biológicas quando o ensaio é comparado a outros métodos.
Introduction
O primeiro passo para identificar tratamentos eficazes contra o câncer é a seleção de um robusto e imparcial ensaio de citotoxicidade que pode ser usado para examinar o efeito do tratamento. Uma escolha comum para experimentos de baixo rendimento é a exclusão do corante azul trypan das células vivas. Este método é favorecido porque permite um método relativamente imparcial para quantificar a sobrevivência celular. trypan azul passivamente difunde em células cujas membranas estão comprometidas, mas é efetivamente impedido de entrar em células saudáveis1. O quociente das células vivas e do total das células representa a viabilidade percentual, o que indica a eficácia do tratamento. A desvantagem mais significativa do ensaio azul trypan é que ele é mal adequado para metodologias de alta produtividade. Tem uma relação sinal-ruído relativamente baixa e a coloração prolongada pode resultar em artefatos devido à coloração de células viáveis. Consequentemente, a exclusão azul trypan é tipicamente, mas nem sempre2, relegada à contagem manual. Isso o torna muito lento e introduz a forte possibilidade de viés devido ao julgamento subjetivo do pesquisador (a menos que sejam utilizadas contagens cegas ou independentes, o que reduz ainda mais o rendimento laboratorial). Em geral, o rendimento deste ensaio é insuficiente para a descoberta moderna de drogas.
Os ensaios de viabilidade, que geralmente têm um rendimento muito maior, permitem que os pesquisadores contornem essa limitação, mas vêm com ressalvas significativas (ver Tabela 1). Esses métodos geralmente se enquadram em dois grupos. Um grupo é composto por ensaios colorimétricos que são baseados na função das enzimas de redox celular. Substratos incolores ou não fluorescentes são convertidos em produtos vibrantes que podem ser quantificados usando um espectrofotômetro. Exemplos clássicos incluem sais de tetrazolium (MTT, WST-1, XTT, etc.) e resazurina. Esta categoria também inclui ensaios luminescentes que utilizam luciferina para avaliar o nível ATP. Ensaios deste tipo têm a limitação subjacente de que eles estão medindo o metabolismo celular, que não é a viabilidade celular em si. É bastante comum que as células se tornem quiescentes em condições adversas, mas ainda mantêm a capacidade de dividir3,4,5. Por exemplo, as células-tronco cancerígenas são muitas vezes relativamente metabolicamente quiescentes6,7,8,9, e são susceptíveis de ser difíceis de avaliar usando essas técnicas. A eficácia de tratamentos que prejudicam a função mitocondrial, como a maioria dos mitocanos, também é provável que seja significativamente superestimada.
Uma metodologia alternativa aproveita as propriedades químicas de várias substâncias que lhes permitem atravessar ou não membranas biológicas. Um exemplo são manchas nucleares como SYTOX ou propidium iodide (PI). Esta categoria também inclui ensaios semelhantes no conceito, mas diferentes em função, como o ensaio lactato desidrogenase (LDH), que mede a liberação de LDH no meio extracelular como um indicador de necrose celular(Figura 1,Tabela 1). Estes ensaios são mais capazes de distinguir entre células metabolicamente inativas e mortas.
| Ensaio/corante | Tipos(s) de morte celular detectada | Equipamento necessário | Principais características |
| MTT, CKK-8, Alamar Blue (resazurin) | Apoptose/Necrose | Espectrofotômetro | Barato, rápido; ensaio de ponto final; dependente da atividade das enzimas (exclusivamente mitocondrial no caso de MTT) e não discrimina entre modos de morte celular1,10 |
| Lançamento do LDH | Necrose | Espectrofotômetro | Rápido, independente da atividade das enzimas mitocondriais; caro para testes de alto rendimento; detecta células necróticas com membrana plasmática compromizada11,12 |
| Trypan Blue (TB) | Apoptose/Necrose | Microscópio | Célula-impermeável; não discrimina entre modos de morte celular; laborous e não é adequado para triagem de alto rendimento; mais difícil de usar com células aderentes; propenso a julgamento subjetivo do usuário, mas é considerado o método padrão de medição de viabilidade celular13 |
| Laranja acridina (AO) | Apoptose/Necrose/ | Microscópio de fluorescência | Um corante de ácido nucleico com propriedades espectrais únicas, pode distinguir entre apoptose e necrose/necroptose14 |
| Necroptose | |||
| Hoechst 33342, DAPI | Apoptose | Microscópio de fluorescência ou citômetro de fluxo | Célula permeável; inapropriado por si só para monitorar a morte celular; útil para a co-coloração; podem ser utilizados para avaliar a condensação da cromatina e a fragmentação dos núcleos na apoptose precoce; pode ser emparelhado com iodeto propidium para distinguir apoptose da necrose15,16 |
| Iodeto de propidium (PI) | Apoptose tardia/Necrose | Microscópio de fluorescência ou citômetro de fluxo | Intercalador de células impermeável; detecta os modos de apoptose tardia e necrose da mortecelular 17. Tóxico e permeável após longos tempos de incubação18 |
Mesa 1. Lista de ensaios de citotoxicidade. Ensaios de citotoxicidade, alguns dos quais foram utilizados neste estudo, listados juntamente com a breve descrição de suas principais características.
Estudos recentes demonstraram que o metabolismo mitocondrial é alterado em alguns cânceres19,20,21,22,23,24,25. Por exemplo, leucemias mielóides agudas (LMA) têm sido mostradas para aumentar sua massa mitocondrial, conteúdo mtDNA e respiração mitocondrial para atender às suas demandas energéticas19,26,27. Por outro lado, alguns tumores sólidos são caracterizados por disfunção mitocondrial, ou melhor, “reprogramação metabólica”, como a redução da regulação de proteínas mitocondriais envolvidas no OXPHOS ou diminuição do teor de MTDNA, que tem sido associada à invasão tumoral, potencial metastático e resistência a medicamentos indutores de apoptose28,29. Além disso, recentemente, houve um aumento do interesse em usar compostos mecanicamente diversos que afetam a função mitocondrial (geralmente chamadas mitocans30), como terapias potenciais para determinados cânceres. Essas drogas têm como alvo a síntese ATP, DNA mitocondrial, OXPHOS e produção ros, bem como proteínas pró-apoptóticas e anti-apoptóticas associadas às mitocôndrias30,31. Vários estudos têm demonstrado que essa abordagem tem uma promessa significativa19,32,33,34. No entanto, esses desvios metabólicos na biologia celular do câncer ou tratamentos direcionados a mitocôndrias podem afetar significativamente ensaios de viabilidade convencional que são baseados na funcionalidade mitocondrial.
Aqui, é descrito um protocolo otimizado para um ensaio diferenciado de coloração nuclear. O protocolo permite uma determinação rápida e precisa da citotoxicidade das mitocanas ou suas combinações com outros compostos. Hoechst 33342 é um corante nuclear permeante celular que prontamente cruza as membranas celulares para manchar o DNA, permitindo que a contagem total de células seja obtida. Ao co-coloração com PI, que só entra nos núcleos de células mortas, a proporção de células vivas (somente hoechst) e mortas (manchadas com ambas) podem ser determinadas com precisão. Este protocolo refina o ensaio publicado35 adicionando um passo para a otimização da concentração de corante (cruzando resultados com método azul de trippan ortogonal) e centrifugação da placa antes da imagem. Como muitas linhas celulares são semi-aderentes ou suspensas, a centrifugação aumenta a proporção de células que são imagens e melhora fortemente a precisão. O ensaio tem várias vantagens, incluindo que a coloração não requer remoção de mídia ou lavagem. A mistura de corante também é barata, fácil de preparar e compatível com sistemas multicanais/robóticos de tubulação.
Depois que as células foram manchadas, elas são imagens com um microscópio automatizado. Isso tem a vantagem adicional de criar um registro permanente das imagens que podem ser re-analisadas posteriormente e os efeitos de determinados compostos podem ser reavaliados por inspeção visual de imagens capturadas. Uma vez obtidas imagens, as células podem ser contadas manualmente ou usando qualquer um dos vários pacotes de software, incluindo tanto gratuitos (por exemplo, ImageJ, CellProfiler, etc) quanto software comercial (por exemplo, Metamorfo, Gen5, etc). A contagem automatizada de células é geralmente preferível, uma vez que os pipelines automatizados de contagem de células desenvolvidos adequadamente são mais precisos e menos tendenciosos do que as contagens manuais. Eles também desconsideram mais efetivamente detritos celulares ou complexos insolúveis. O desenvolvimento desses gasodutos é geralmente simples e é simplificado pela eficiência das manchas utilizadas. A saída é quantitativa, uma vez que o número real de células mortas é calculado automaticamente em relação ao número total da célula, e diferentes limiares podem ser aplicados para aumentar ou diminuir a stringency da detecção35. Para conveniência, parâmetros otimizados para contar células usando o software Gen5 v. 3.00 compatível com software Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader estão incluídos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Embora o protocolo para o ensaio de citotoxicidade Hoechst/PI seja robusto e exija relativamente pouco tempo prático, existem vários detalhes experimentais que são muito importantes para garantir resultados precisos. Em primeiro lugar, é essencial garantir que a concentração de DMSO permaneça abaixo de 0,5% (v/v). É geralmente acordado que a exposição a doses até baixas de DMSO pode alterar substancialmente a morfologia e a fixação das células e retardar significativamente a progressão do ciclo celular<sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A NVK, uma estudiosa da CPRIT em Pesquisa do Câncer, agradece ao Instituto de Prevenção e Pesquisa do Câncer do Texas (CPRIT) por seu generoso apoio, a CPRIT concede RR150044. Este trabalho também foi apoiado pelo Welch Foundation Research Grant C-1930, e pelos Institutos Nacionais de Saúde R35 GM129294 concedidos à NVK. Os financiadores não tiveram papel na concepção do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicar ou elaboração do manuscrito.
Materials
| 2-Deoxy-D-glucose/2-DG | Chem-Impex | 50-519-067 | |
| 3-bromo-pyruvate | Alfa Aesar | 1113-59-3 | |
| 96-Well plates | Greiner Bio-One | 655090 | Black or clear flat-bottomed 96-well plates |
| Alamar blue HS cell viability reagent (100mL) | Thermo Fisher | A50101 | |
| Countess II automated cell counter | Thermo Fisher | ||
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader | BioTek | ||
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | 62249 | 20 mM solution; final concentration 1:1,000 |
| HyClone fetal bovine serum | GE Healthcare | #25-514 | |
| m-chlorophenylhydrazone/CCCP | Sigma Aldrich | C2759 | |
| PBS tablets | Thermo Fisher | BP2944100 | 1 tablet + 200 mL of sterile water = 1x PBS solution |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X) | Gibco | 10378016 | |
| Pierce LDH assay kit | Thermo Fisher | 50-103-5952 | |
| Propidium Iodide | Thermo Fisher | 50-596-072 | Dry powder; stock 1 mg/mL in PBS; final concentration 5 µg/mL (leukemia cells), 1 µg/mL (normal PBMCs) |
| Rotenone | Ark Pharm | AK115691 | |
| RPMI-1640 Medium With L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
Sigma Aldrich | R8758-500ML | |
| Thiazolyl blue tetrazolium bromide | ACROS Organics | AC158990010 | |
| Trypan blue stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Cell lines | |||
| K562 | ATCC | CCL-243 | CML cell line |
| MOLM-13 | ATCC | AML cell line |
|
| MOLT-4 | ATCC | CRL-1582 | ALL cell line |
| OCI-AML2 | ATCC | AML cell line |
|
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