Een geautomatiseerde differentiële nucleaire kleuringtest voor nauwkeurige bepaling van Mitocan Cytotoxicity
Summary
Het protocol beschrijft een snelle, hoge doorvoer, betrouwbare, goedkope en onpartijdige test voor het efficiënt bepalen van cellulaire levensvatbaarheid. Deze test is vooral handig wanneer de mitochondriën van cellen zijn beschadigd, wat interfereert met andere tests. De test maakt gebruik van geautomatiseerd tellen van cellen bevlekt met twee nucleaire kleurstoffen – Hoechst 33342 en propidium jodide.
Abstract
De bijdrage van mitochondriën aan oncogene transformatie is een onderwerp van brede belangstelling en actieve studie. Naarmate het gebied van kankermetabolisme complexer wordt, wordt het doel van het richten van mitochondriën met behulp van verschillende verbindingen die mitochondriale schade toebrengen (zogenaamde mitocans) steeds heel populair. Helaas vereisen veel bestaande cytotoxiciteitstesten, zoals die op basis van tetrazoliumzouten of resazurine functionele mitochondriale enzymen vereisen voor hun prestaties. De schade toegebracht door verbindingen die gericht mitochondriën vaak compromissen de nauwkeurigheid van deze tests. Hier beschrijven we een gewijzigd protocol op basis van differentiële kleuring met twee fluorescerende kleurstoffen, waarvan er een cel-permeant is (Hoechst 33342) en de andere niet (propidium jodide). Het verschil in kleuring maakt het mogelijk levende en dode cellen te worden gediscrimineerd. De test is vatbaar voor geautomatiseerde microscopie en beeldanalyse, die de doorvoer verhoogt en bias vermindert. Dit maakt het ook mogelijk de test te worden gebruikt in high-throughput mode met behulp van 96-well platen, waardoor het een haalbare optie voor drugs ontdekking inspanningen, met name wanneer de drugs in kwestie hebben een bepaald niveau van mitotoxiciteit. Belangrijk is dat de resultaten verkregen door Hoechst / PI kleuring test tonen een verhoogde consistentie, zowel met trypan blauwe uitsluiting resultaten en tussen biologische replica’s wanneer de test wordt vergeleken met andere methoden.
Introduction
De eerste stap naar het identificeren van effectieve behandelingen van kanker is de selectie van een robuuste, onpartijdige cytotoxiciteitstest die kan worden gebruikt om het effect van de behandeling te onderzoeken. Een gemeenschappelijke keuze voor low-throughput experimenten is de uitsluiting van trypan blauwe kleurstof uit levende cellen. Deze methode is favoriet omdat het een relatief onbevooroordeelde methode voor het kwantificeren van celoverleving mogelijk maakt. trypan blauw verspreidt zich passief in cellen waarvan de membranen zijn aangetast, maar het is effectief geblokkeerd van het invoeren van gezonde cellen1. Het quotiënt van de levende cellen en de totale cellen vertegenwoordigt het percentage levensvatbaarheid, wat de werkzaamheid van de behandeling aangeeft. Het belangrijkste nadeel van de trypan blauwe test is dat het slecht geschikt is voor high-throughput methodologieën. Het heeft een relatief lage signaal-ruisverhouding en langdurige vlekken kunnen resulteren in artefacten als gevolg van de kleuring van levensvatbare cellen. Bijgevolg, trypan blauwe uitsluiting is meestal, maar niet altijd2, gedegradeerd tot handmatig tellen. Dit maakt het te traag en introduceert de sterke mogelijkheid van bias als gevolg van subjectief oordeel van de onderzoeker (tenzij verblindende of onafhankelijke tellingen worden gebruikt, die verder verminderen laboratoriumdoorvoer). In het algemeen is de doorvoer van deze test onvoldoende voor moderne drugsontdekking.
De levensvatbaarheidstesten, die over het algemeen een veel hogere doorvoer hebben, stellen onderzoekers in staat om deze beperking te omzeilen, maar komen met aanzienlijke kanttekeningen (zie tabel 1). Deze methoden vallen over het algemeen in twee groepen. Een groep bestaat uit colorimetrische tests die gebaseerd zijn op de functie van cellulaire redox enzymen. Kleurloze of niet-fluorescerende substraten worden omgezet in levendige producten die kunnen worden gekwantificeerd met behulp van een spectrofotometer. Klassieke voorbeelden zijn tetrazoliumzouten (MTT, WST-1, XTT, enz.) en resazurin. Deze categorie omvat ook luminescente testen die luciferin gebruiken om ATP-niveau te evalueren. Tests van dit type hebben de onderliggende beperking dat ze cellulaire metabolisme meten, dat is niet cellulair levensvatbaarheid per se. Het is heel gebruikelijk dat cellen rustig worden onder ongunstige omstandigheden, maar toch de mogelijkheid behoudenom3,4,5te verdelen . Kankercellen zijn bijvoorbeeld vaak relatief metabolisch rustige6,7,8,9, en zijn waarschijnlijk moeilijk te testen met behulp van deze technieken. Effectiviteit van behandelingen die mitochondriale functie beschadigen, zoals de meeste mitocanen, is ook waarschijnlijk aanzienlijk worden overschat.
Een alternatieve methodologie maakt gebruik van de chemische eigenschappen van verschillende stoffen die hen in staat stellen om biologische membranen al dan niet kruisen. Een voorbeeld zijn nucleaire vlekken zoals SYTOX of propidium jodide (PI). Deze categorie omvat ook tests die qua concept vergelijkbaar zijn, maar verschillend van functie zijn, zoals de lactaatdehydrogenase (LDH), die het vrijkomen van LDH in de extracellulaire milieumaatregelen meet als een indicator van cellulaire necrose(figuur 1, tabel 1). Deze testen zijn beter in staat om onderscheid te maken tussen metabolisch inactieve en dode cellen.
| Test/kleurstof | Type(s) van de ontdekte celdood | Noodzakelijke apparatuur | Belangrijkste kenmerken |
| MTT, CKK-8, Alamar Blue (resazurin) | Apoptose/Necrose | Spectrofotometer | Goedkoop, snel; eindpunttest; afhankelijk van de activiteit van enzymen (uitsluitend mitochondriaal in geval van MTT) en maakt geen onderscheid tussen de wijzen van celdood1,10 |
| LDH-release | Necrose | Spectrofotometer | Snel, onafhankelijk van de activiteit van mitochondriale enzymen; duur voor tests met een hoge doorvoer; detecteert necrotische cellen met gecompromiseerd plasmamembraan11,12 |
| Trypan Blauw (TB) | Apoptose/Necrose | Microscoop | Cel-ondoordringbaar; maakt geen onderscheid tussen vormen van celdood; moeizaam en niet geschikt voor screening met hoge doorvoer; moeilijker te gebruiken met aanhangende cellen; gevoelig voor subjectief oordeel van de gebruiker, maar wordt beschouwd als de standaard cel levensvatbaarheid meting methode13 |
| Acridine oranje (AO) | Apoptose/Necrose/ | Fluorescentiemicroscoop | Een nucleïnezuurkleurstof met unieke spectrale eigenschappen, kan onderscheid maken tussen apoptose en necrose/necroptose14 |
| Necroptosis | |||
| Hoechst 33342, DAPI | Apoptosis | Fluorescentie microscoop of flow cytometer | Cel-doorlaatbaar; ongepast op zijn eigen om celdood te controleren; nuttig voor co-kleuring; kan worden gebruikt om chromatinecondensatie en kernfragmentatie in vroege apoptose te beoordelen; kan worden gecombineerd met propidiumjodide om apoptose te onderscheiden van necrose15,16 |
| Propidium Iodide (PI) | Late apoptose/Necrose | Fluorescentie microscoop of flow cytometer | Cel-ondoordringbaar intercalator; detecteert zowel late apoptose als necrosemodi van celdood17. Giftig en doorlaatbaar na lange incubatietijden18 |
Tabel 1. Lijst van cytotoxiciteitstesten. Cytotoxiciteit testen, waarvan sommige werden gebruikt in deze studie, vermeld samen met de korte beschrijving van hun belangrijkste kenmerken.
Recente studies hebben aangetoond dat het mitochondriale metabolisme bij sommige vormen van kanker19, 20,21,22,23,24,25wordt gewijzigd . Bijvoorbeeld, acute myeloïde leukemie (AML) is aangetoond dat hun mitochondriale massa, mtDNA-gehalte en mitochondriale ademhaling te upreguleren om te voldoen aan hun energiebehoeften19,26,27. Aan de andere kant worden sommige vaste tumoren gekenmerkt door mitochondriale disfunctie, of liever “metabole herprogrammering”, zoals downregulatie van mitochondriale eiwitten die betrokken zijn bij OXPHOS of verminderde mtDNA-inhoud, die is geassocieerd met tumor invasieve, gemetastaseerde potentieel en resistentie tegen apoptose-inducerende geneesmiddelen28,29. Bovendien, onlangs, is er een verhoogde interesse in het gebruik van mechanistisch diverse verbindingen die mitochondriale functie beïnvloeden (over het algemeen mitocans30genoemd), als potentiële therapieën voor bepaalde vormen van kanker. Deze geneesmiddelen richten zich op ATP-synthese, mitochondriaal DNA, OXPHOS en ROS-productie, evenals pro-apoptotische en anti-apoptotische eiwitten geassocieerd met mitochondriën30,31. Verschillende studies hebben aangetoond dat deze aanpak een belangrijke belofteheeft 19,32,33,34. Echter, deze metabole afwijkingen in kankercelbiologie of mitochondriën-targeting behandelingen kunnen aanzienlijke invloed hebben op conventionele levensvatbaarheid tests die zijn gebaseerd op mitochondriale functionaliteit.
Hier wordt een geoptimaliseerd protocol voor een differentiële nucleaire kleuringstest beschreven. Het protocol maakt een snelle en nauwkeurige bepaling van cytotoxiciteit van mitocans of hun combinaties met andere verbindingen. Hoechst 33342 is een cel-permeant nucleaire kleurstof die gemakkelijk celmembranen kruist om DNA te bevlekken, waardoor het totale aantal cellen kan worden verkregen. Door co-kleuring met PI, die alleen in de kernen van dode cellen, het aandeel van het leven (Hoechst alleen) en dode (gekleurd met beide) cellen nauwkeurig kan worden bepaald. Dit protocol verfijnt de gepubliceerde test35 door het toevoegen van een stap voor de optimalisatie van de kleurstof concentratie (door cross-referencing resultaten met orthogonale trypan blauwe methode) en centrifugatie van de plaat voorafgaand aan beeldvorming. Aangezien veel cellijnen semi-aanhangend of opgeschort zijn, verhoogt centrifugatie het aandeel cellen dat in beeld is en verbetert de nauwkeurigheid sterk. De test heeft verschillende voordelen, waaronder dat vlekken geen verwijdering van media of wassen vereisen. De kleurstof mengsel is ook goedkoop, gemakkelijk te bereiden, en compatibel met multichannel / robot pipetting systemen.
Nadat cellen zijn gekleurd, worden ze afgebeeld met een geautomatiseerde microscoop. Dit heeft het extra voordeel van het creëren van een permanente record van de beelden die later opnieuw kunnen worden geanalyseerd en de effecten van bepaalde verbindingen kunnen opnieuw worden geëvalueerd door visuele inspectie van vastgelegde beelden. Zodra afbeeldingen zijn verkregen, kunnen cellen handmatig worden geteld of met behulp van een van de verschillende softwarepakketten, waaronder zowel gratis (bijvoorbeeld ImageJ, CellProfiler, enz.) als commerciële software (bijvoorbeeld Metamorph, Gen5, enz.). Geautomatiseerde cel tellen is over het algemeen de voorkeur, omdat goed ontwikkeld geautomatiseerde cel tellen pijpleidingen zijn nauwkeuriger en minder bevooroordeeld dan handmatige telt. Ze negeren ook effectiever celpuin of onoplosbare complexen. De ontwikkeling van deze pijpleidingen is over het algemeen eenvoudig en wordt vereenvoudigd door de efficiëntie van de gebruikte vlekken. De uitvoer is kwantitatief omdat het werkelijke aantal dode cellen automatisch wordt berekend met betrekking tot het totale celaantal en verschillende drempelwaarden kunnen worden toegepast om de stringentie van detectie35te verhogen of te verlagen. Voor het gemak zijn geoptimaliseerde parameters voor het tellen van cellen met Gen5 v. 3.00-compatibele Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader inbegrepen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hoewel het protocol voor Hoechst/PI cytotoxiciteitstest robuust is en relatief weinig hands-on tijd vereist, zijn er verschillende experimentele details die erg belangrijk zijn om nauwkeurige resultaten te garanderen. Ten eerste is het essentieel om ervoor te zorgen dat de concentratie van DMSO onder 0,5% (v/v) blijft. Over het algemeen is men het erover eens dat blootstelling aan zelfs lage doses DMSO de morfologie en gehechtheid van cellen aanzienlijk kan veranderen en de progressie van de celcyclus aanzienlijk kan ver…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NVK, een CPRIT geleerde in Cancer Research, dankt het Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT) voor hun genereuze steun, CPRIT subsidie RR150044. Dit werk werd ook ondersteund door de Welch Foundation Research Grant C-1930, en door de National Institutes of Health R35 GM129294 toegekend aan NVK. De financiers hadden geen rol in het ontwerp van de studie, het verzamelen en analyseren van gegevens, het besluit om het manuscript te publiceren of de voorbereiding van het manuscript.
Materials
| 2-Deoxy-D-glucose/2-DG | Chem-Impex | 50-519-067 | |
| 3-bromo-pyruvate | Alfa Aesar | 1113-59-3 | |
| 96-Well plates | Greiner Bio-One | 655090 | Black or clear flat-bottomed 96-well plates |
| Alamar blue HS cell viability reagent (100mL) | Thermo Fisher | A50101 | |
| Countess II automated cell counter | Thermo Fisher | ||
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader | BioTek | ||
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | 62249 | 20 mM solution; final concentration 1:1,000 |
| HyClone fetal bovine serum | GE Healthcare | #25-514 | |
| m-chlorophenylhydrazone/CCCP | Sigma Aldrich | C2759 | |
| PBS tablets | Thermo Fisher | BP2944100 | 1 tablet + 200 mL of sterile water = 1x PBS solution |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X) | Gibco | 10378016 | |
| Pierce LDH assay kit | Thermo Fisher | 50-103-5952 | |
| Propidium Iodide | Thermo Fisher | 50-596-072 | Dry powder; stock 1 mg/mL in PBS; final concentration 5 µg/mL (leukemia cells), 1 µg/mL (normal PBMCs) |
| Rotenone | Ark Pharm | AK115691 | |
| RPMI-1640 Medium With L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
Sigma Aldrich | R8758-500ML | |
| Thiazolyl blue tetrazolium bromide | ACROS Organics | AC158990010 | |
| Trypan blue stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Cell lines | |||
| K562 | ATCC | CCL-243 | CML cell line |
| MOLM-13 | ATCC | AML cell line |
|
| MOLT-4 | ATCC | CRL-1582 | ALL cell line |
| OCI-AML2 | ATCC | AML cell line |
|
References
- Ramirez, C. N., Antczak, C., Djaballah, H. Cell viability assessment: toward content-rich platforms. Expert Opinion on Drug Discovery. 5 (3), 223-233 (2010).
- Melzer, S., et al. Trypan blue as an affordable marker for automated live-dead cell analysis in image cytometry. Scanning. 38 (6), 857-863 (2016).
- Sikora, E., Mosieniak, G., Sliwinska, M. A. Morphological and Functional Characteristic of Senescent Cancer Cells. Current Cancer Drug Targets. 17 (4), 377-387 (2016).
- Coppé, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annual Review of Pathology. 5, 99-118 (2010).
- Castro-Vega, L. J., et al. The senescent microenvironment promotes the emergence of heterogeneous cancer stem-like cells. Carcinogenesis. 36 (10), 1180-1192 (2015).
- Weihua, Z., Lin, Q., Ramoth, A. J., Fan, D., Fidler, I. J. Formation of solid tumors by a single multinucleated cancer cell. Cancer. 117 (17), 4092-4099 (2011).
- Osisami, M., Keller, E. T. Mechanisms of Metastatic Tumor Dormancy. Clinical Medicine. 2 (3), 136-150 (2013).
- Zhang, S., et al. Generation of cancer stem-like cells through the formation of polyploid giant cancer cells. Oncogene. 33 (1), 116-128 (2014).
- Mittal, K., et al. Multinucleated polyploidy drives resistance to Docetaxel chemotherapy in prostate cancer. British Journal of Cancer. 116 (9), 1186-1194 (2017).
- McKeague, A. L., Wilson, D. J., Nelson, J. Staurosporine-induced apoptosis and hydrogen peroxide-induced necrosis in two human breast cell lines. British Journal of Cancer. 88 (1), 125-131 (2003).
- Kaja, S., et al. An optimized lactate dehydrogenase release assay for screening of drug candidates in neuroscience. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 73, 1-6 (2015).
- Chan, F. K., Moriwaki, K., De Rosa, M. J. Detection of necrosis by release of lactate dehydrogenase activity. Methods in Molecular Biology. 979, 65-70 (2013).
- Piccinini, F., Tesei, A., Arienti, C., Bevilacqua, A. Cell Counting and Viability Assessment of 2D and 3D Cell Cultures: Expected Reliability of the Trypan Blue Assay. Biological Procedures Online. 19, 8 (2017).
- Plemel, J. R., et al. Unique spectral signatures of the nucleic acid dye acridine orange can distinguish cell death by apoptosis and necroptosis. Journal of Cell Biology. 216 (4), 1163-1181 (2017).
- Galluzzi, L., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death & Differentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).
- Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. Measurement of cell death in mammalian cells. Current Protocols in Pharmacology. , (2004).
- Brauchle, E., Thude, S., Brucker, S. Y., Schenke-Layland, K. Cell death stages in single apoptotic and necrotic cells monitored by Raman microspectroscopy. Scientific Reports. 4, 4698 (2014).
- Chiaraviglio, L., Kirby, J. E. Evaluation of impermeant, DNA-binding dye fluorescence as a real-time readout of eukaryotic cell toxicity in a high throughput screening format. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 219-228 (2014).
- Panina, S. B., Baran, N., Brasil da Costa, F. H., Konopleva, M., Kirienko, N. V. A mechanism for increased sensitivity of acute myeloid leukemia to mitotoxic drugs. Cell Death & Disease. 10 (8), 617 (2019).
- Caro, P., et al. Metabolic signatures uncover distinct targets in molecular subsets of diffuse large B cell lymphoma. Cancer Cell. 22 (4), 547-560 (2012).
- Lagadinou, E. D., et al. BCL-2 inhibition targets oxidative phosphorylation and selectively eradicates quiescent human leukemia stem cells. Cell Stem Cell. 12 (3), 329-341 (2013).
- Senft, D., Ronai, Z. A. Regulators of mitochondrial dynamics in cancer. Current Opinion in Cell Biology. 39, 43-52 (2016).
- Vazquez, F., et al. PGC1α expression defines a subset of human melanoma tumors with increased mitochondrial capacity and resistance to oxidative stress. Cancer Cell. 23 (3), 287-301 (2013).
- Caino, M. C., Altieri, D. C. Cancer cells exploit adaptive mitochondrial dynamics to increase tumor cell invasion. Cell Cycle. 14 (20), 3242-3247 (2015).
- Ralph, S. J., Rodríguez-Enríquez, S., Neuzil, J., Saavedra, E., Moreno-Sánchez, R. The causes of cancer revisited: “mitochondrial malignancy” and ROS-induced oncogenic transformation – why mitochondria are targets for cancer therapy. Molecular Aspects of Medicine. 31 (2), 145-170 (2010).
- Kreitz, J., et al. Metabolic Plasticity of Acute Myeloid Leukemia. Cells. 8 (8), (2019).
- Sriskanthadevan, S., et al. AML cells have low spare reserve capacity in their respiratory chain that renders them susceptible to oxidative metabolic stress. Blood. 125 (13), 2120-2130 (2015).
- Guerra, F., et al. Mitochondrial Dysfunction: A Novel Potential Driver of Epithelial-to-Mesenchymal Transition in Cancer. Frontiers in Oncology. 7, 295 (2017).
- Guerra, F., Arbini, A. A., Moro, L. Mitochondria and cancer chemoresistance. Biochimica et Biophysica Acta. 1858 (8), 686-699 (2017).
- Neuzil, J., Dong, L. F., Rohlena, J., Truksa, J., Ralph, S. J. Classification of mitocans, anti-cancer drugs acting on mitochondria. Mitochondrion. 13 (3), 199-208 (2013).
- Ubah, O. C., Wallace, H. M. Cancer therapy: Targeting mitochondria and other sub-cellular organelles. Current Pharmaceutical Design. 20 (2), 201-222 (2014).
- Yamaguchi, R., et al. Efficient elimination of cancer cells by deoxyglucose-ABT-263/737 combination therapy. PLoS One. 6 (9), 24102 (2011).
- Hahn, T., et al. Use of anti-cancer drugs, mitocans, to enhance the immune responses against tumors. Current Pharmaceutical Biotechnology. 14 (3), 357-376 (2013).
- Panina, S. B., Pei, J., Baran, N., Konopleva, M., Kirienko, N. V. Utilizing Synergistic Potential of Mitochondria-Targeting Drugs for Leukemia Therapy. Frontiers in Oncology. 10, 435 (2020).
- Lema, C., Varela-Ramirez, A., Aguilera, R. J. Differential nuclear staining assay for high-throughput screening to identify cytotoxic compounds. Current Cellular Biochemistry. 1 (1), 1-14 (2011).
- Döhner, H., et al. Diagnosis and management of acute myeloid leukemia in adults: recommendations from an international expert panel, on behalf of the European LeukemiaNet. Blood. 115 (3), 453-474 (2010).
- Heinz, S., et al. Mechanistic Investigations of the Mitochondrial Complex I Inhibitor Rotenone in the Context of Pharmacological and Safety Evaluation. Scientific Reports. 7, 45465 (2017).
- Fan, T., et al. Tumor Energy Metabolism and Potential of 3-Bromopyruvate as an Inhibitor of Aerobic Glycolysis: Implications in Tumor Treatment. Cancers (Basel). 11 (3), (2019).
- Pal, R., Mamidi, M. K., Das, A. K., Bhonde, R. Diverse effects of dimethyl sulfoxide (DMSO) on the differentiation potential of human embryonic stem cells. Archives of Toxicology. 86 (4), 651-661 (2012).
- Tunçer, S., et al. Low dose dimethyl sulfoxide driven gross molecular changes have the potential to interfere with various cellular processes. Scientific Reports. 8 (1), 14828 (2018).
