Summary

Aplicación de terapia de phage para contrarrestar la infección por Pseudomonas aeruginosa en embriones de peces cebra de fibrosis quística

Published: May 12, 2020
doi:

Summary

Aquí se presenta un protocolo para la infección por Pseudomonas aeruginosa y la aplicación de terapia de fagos en embriones de peces cebra de fibrosis quística (CF).

Abstract

La resistencia a los antimicrobianos, una consecuencia importante de la incertidumbre diagnóstica y la sobrescripción antimicrobiana, es una causa cada vez más reconocida de infecciones graves, complicaciones y mortalidad en todo el mundo con un enorme impacto en nuestra sociedad y en el sistema de salud. En particular, los pacientes con sistemas inmunitarios comprometidos o patologías preexistentes y crónicas, como la fibrosis quística (CF), son sometidos a frecuentes tratamientos antibiótico para controlar las infecciones con la aparición y difusión de aislados multirresistentes. Por lo tanto, hay una necesidad urgente de abordar terapias alternativas para contrarrestar las infecciones bacterianas. El uso de bacteriófagos, los enemigos naturales de las bacterias, puede ser una posible solución. El protocolo detallado en este trabajo describe la aplicación de la terapia de fagos contra la infección por Pseudomonas aeruginosa en embriones de pez cebra CF. Los embriones de pez cebra se infectaron con P. aeruginosa para demostrar que la terapia de fagos es eficaz contra las infecciones por P. aeruginosa, ya que reduce la letalidad, la carga bacteriana y la respuesta inmunitaria proinflamatoria en embriones CF.

Introduction

La terapia de fagos, el uso de los enemigos naturales de las bacterias para combatir las infecciones bacterianas, está acayendo un renovado interés a medida que la resistencia bacteriana a los antibióticos se generaliza1,,2. Esta terapia, utilizada durante décadas en Europa del Este, podría considerarse un tratamiento complementario a los antibióticos en el curado de infecciones pulmonares en pacientes con FQ y una posible alternativa terapéutica para pacientes infectados con bacterias que son resistentes a todos los antibióticos actualmente en uso2,,3. Las ventajas de la terapia antibiótica son que los bacteriófagos se multiplican en el lugar de la infección, mientras que los antibióticos se metabolizan y eliminan del cuerpo4,,5. De hecho, la administración de cócteles de fagos virulentos aislados en diferentes laboratorios ha demostrado ser eficaz en el tratamiento de las infecciones por Pseudomonas aeruginosa en modelos animales tan diferentes como insectos y mamíferos6,,7,,8. La terapia de fagos también demostró ser capaz de reducir la carga bacteriana en las heridas por quemaduras infectadas con P. aeruginosa y Escherichia coli en un ensayo clínico aleatorizado9.

El pez cebra (Danio rerio) ha surgido recientemente como un modelo valioso para estudiar infecciones con varios patógenos, incluyendo P. aeruginosa10,11, Mycobacterium abscessus y Burkolderia cepacia12,13. Mediante la microinyección de bacterias directamente en la circulación sanguínea embrionaria14 es fácil establecer una infección sistémica que es contrarrestado por el sistema inmune innato de pez cebra, que es evolutivo conservado con neutrófilos y generación de macrófagos similar a la contraparte humana. Además, durante el primer mes de vida, los embriones de pez cebra carecen de la respuesta inmune adaptativa, lo que los convierte en modelos ideales para estudiar la inmunidad innata, que es el mecanismo crítico de defensa en las infecciones pulmonares humanas15. Zebrafish surgió recientemente como un potente sistema de modelos genéticos para comprender mejor el inicio del CF y desarrollar nuevos tratamientos farmacológicos10,,16,,17. El modelo de pez cebra CF de derribo de cftr generado con inyección de morfolino en peces cebra presentó una respuesta amortiguada de ráfaga respiratoria y una migración de neutrófilos reducida10,mientras que el knock-out del cftr conduce a una alteración de la posición interna del órgano y a la destrucción del páncreas exocrino, un fenotipo que refleja la enfermedad humana16,,17. De mayor interés fue la constatación de que la carga bacteriana de P. aeruginosa fue significativamente mayor en embriones cftr-pérdida de función que en controles a las 8 horas posteriores a la infección (hpi), que es paralela a los resultados obtenidos con ratones y células epiteliales bronquiales humanas2,18.

En este trabajo, demostramos que la terapia de fagos es eficaz contra las infecciones por P. aeruginosa en embriones de pez cebra.

Protocol

El pez cebra adulto (Danio rerio) de la cepa AB (European Zebrafish Resource Center EZRC) se mantiene de acuerdo con las directrices internacionales (Directiva 2010/63/UE de la UE) y nacionales (decreto italiano 4 de marzode 2014, n. 26) sobre la protección de los animales utilizados con fines científicos. Las condiciones estándar se establecen en la instalación de peces con un ciclo oscuro de 14 h de luz/10 h y una temperatura del agua del tanque a 28oC. 1. Preparación …

Representative Results

Los resultados y las cifras aquí presentados se refieren a embriones CF generados a través de la inyección de cftr morpholinos como se describió anteriormente10 y en el paso 5. Para validar el fenotipo CF, se consideró la posición deteriorada de órganos internos como el corazón, el hígado y el páncreas como se describió anteriormente17 (Figura 1). Se obtuvieron resultados similares en el caso de los embriones WT, como se inf…

Discussion

En este manuscrito, describimos el protocolo para realizar la infección por P. aeruginosa (PAO1) en embriones de pez cebra y cómo aplicar la terapia de fagos con un cóctel de fagos previamente identificados como capaces de infectar PAO1 para resolverlo. El uso de bacteriófagos como alternativa a los tratamientos antibiótico ha sido de creciente interés desde los últimos años. Esto se debe principalmente a la difusión de infecciones bacterianas multirresistentes (MDR), que constituyen un problema grave p…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Italiana de Fibrosis Quística (FFC-22/2017; Associazione “Gli amici della Ritty” Casnigo y FFC-23/2019; Un respiro en piá Onlus La Mano tesa Onlus).

Materials

Bacto Agar BD 214010
Calcium chloride Sigma-Aldrich 10043-52-4
CsCl Sigma-Aldrich 289329
Dulbecco's phospate buffered saline PBS Sigma-Aldrich D8537
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate Sigma-Aldrich 886-86-2 common name tricaine
Femtojet Micromanipulator Eppendorf 5247
Fleming/brown P-97 Sutter Instrument Company P-97
LE-Agarose Sigma-Aldrich 11685660001
Low Melting Agarose Sigma-Aldrich CAS 9012-36-6
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich 7487-88-9
Methyl Blue Sigma-Aldrich 28983-56-4
Microinjection needles Harvard apparatus
N-Phenylthiourea >=98% Aldrich-P7629 103-85-5
Oligo Morpholino Gene Tools designed by the researcher
PEG6000 Calbiochem 528877
Phenol Red Solution Sigma-Aldrich CAS 143-74-B
Potassium chloride Sigma-Aldrich 7447-40-7
Pronase Sigma-Aldrich 9036-06-0
Sodium chloride ACS reagent, ≥99.0% Sigma-Aldrich S9888
Stereomicroscope Leica S9I
Tris HCl Sigma-Aldrich T5941
Triton X Sigma-Aldrich T9284
Tryptone Oxoid LP0042B
Yeast extract Oxoid LP0021B
Z-MOLDS Microinjection Word Precision Instruments

References

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Cite This Article
Cafora, M., Forti, F., Briani, F., Ghisotti, D., Pistocchi, A. Phage Therapy Application to Counteract Pseudomonas aeruginosa Infection in Cystic Fibrosis Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (159), e61275, doi:10.3791/61275 (2020).

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