Summary

יישום טיפול Phage כדי לנטרל זיהום aeruginosa פסאודומונס בעוברי דגי זברה סיסטיק פיברוזיס

Published: May 12, 2020
doi:

Summary

מוצג כאן פרוטוקול עבור זיהום Pseudomonas aeruginosa ויישום טיפול phage בעוברי דגי זברה סיסטיק פיברוזיס (CF).

Abstract

עמידות מיקרוביאלית, תוצאה גדולה של אי-ודאות אבחונית ויתור יתר מיקרוביאלי, היא גורם מוכר יותר ויותר לזיהומים חמורים, סיבוכים, ותמותה ברחבי העולם עם השפעה עצומה על החברה שלנו ועל מערכת הבריאות. בפרט, חולים עם מערכות חיסוניות בסכנה או פתולוגיות קיימות וכרוניות מראש, כגון סיסטיק פיברוזיס (CF), נתונים לטיפולים אנטיביוטיים תכופים כדי לשלוט בזיהומים עם המראה ופיזור של מבודדים עמידים multidrug. לכן, יש צורך דחוף לטפל טיפולים חלופיים כדי לנטרל זיהומים חיידקיים. שימוש bacteriophages, האויבים הטבעיים של חיידקים, יכול להיות פתרון אפשרי. הפרוטוקול המפורט בעבודה זו מתאר את היישום של טיפול phage נגד זיהום aeruginosa פסאודומונס בעוברי דגי זברה CF. עוברי דגי זברה נדבקו P. aeruginosa כדי להוכיח כי טיפול phage יעיל נגד P. זיהומים aeruginosa כפי שהוא מפחית קטלניות, נטל חיידקי ותגובה חיסונית פרו דלקתית בעוברי CF.

Introduction

טיפול Phage, השימוש באויבים הטבעיים של חיידקים להילחם בזיהומים חיידקיים, הוא צובר עניין מחודש כמו עמידות חיידקים לאנטיביוטיקה הופךנפוץ 1,,2. טיפול זה, המשמש במשך עשרות שנים במזרח אירופה, יכול להיחשב טיפול משלים לאנטיביוטיקה בריפוי דלקות ריאות בחולים עם CF וחלופה טיפולית אפשרית עבור חולים נגועים בחיידקים עמידים בפני כל הנוכחי בשימושבאנטיביוטיקה 2,3. היתרונות של טיפול אנטיביוטי הם bacteriophages להכפיל באתר הזיהום, בעוד אנטיביוטיקה הם מטבוליזם ומבוטלמהגוף 4,5. אכן, ניהול קוקטיילים של phages ארסי מבודד במעבדות שונות הוכיח להיות יעיל בטיפול בזיהומים aeruginosa פסאודומונס במודלים של בעלי חיים שונה כמו חרקים ויונקים6,7,8. טיפול Phage הוכח גם להיות מסוגל להפחית את הנטל החיידקי בפצעי כוויות נגוע P. aeruginosa ו Escherichia קולי בניסוי קליני אקראי9.

דגי זברה (דניו rerio) לאחרונה התגלה כמודל יקר לחקר זיהומים עם מספר פתוגנים, כולל P. aeruginosa10,,11, מורסה Mycobacterium ו Burkolderia cepacia12,13. על ידי microinjecting חיידקים ישירותלתוך מחזור הדם העובר 14 קל להקים זיהום מערכתי כי הוא מנוטרל על ידי מערכת החיסון המולדת של דגי הזברה, אשר אבולוציונית שמר עם נויטרופילים ודור מקרופאג דומה המקביל האנושי. יתר על כן, במהלך החודש הראשון של החיים, עוברי דגי זברה חסרים את התגובה החיסונית אדפטיבית, מה שהופך אותם מודלים אידיאליים ללימוד החסינות המולדת, שהוא מנגנון ההגנה הקריטי בדלקותריאות אנושיות 15. דגי זברה הופיעו לאחרונה כמערכת מודל גנטי רב עוצמה כדי להבין טוב יותר את תחילת CF ולפתח טיפוליםתרופתיים חדשים 10,16,17. מודל דגי הזברה CF של CFTR נוק-דאון שנוצר עם הזרקת מורפולינו בדעי זברה הציג תגובה התפרצות נשימתית לחה והגירהנויטרופיל מופחתת 10, בעוד נוק אאוט CFTR מוביל לתום איברים פנימי לקוי והרס של הלבלב האקסוקריני, פנוטיפהמשקף מחלה אנושית 16,17. העניין הגדול ביותר היה הממצא כי הנטל החיידקי P. aeruginosa היה גבוה באופן משמעותי בעוברים cftr-אובדן של פונקציה מאשר בפקדים ב 8 שעות לאחר הזיהום (hpi), אשר מקביל את התוצאות שהתקבלו עם עכברים ותאי אפיתל הסיפונותהאנושיים 2,,18.

בעבודה זו, אנו מדגימים כי טיפול phage יעיל נגד P. זיהומים aeruginosa בעוברי דגי זברה.

Protocol

דגי זברה בוגרים(Danio rerio)מזן AB (מרכז המשאבים האירופי של דגי הזברה EZRC) נשמרים על פי הגנה בינלאומית (הנחיית האיחוד האירופי 2010/63/EU) והנחיות לאומיות (צו איטלקי 4מרץ 2014, נ’ 26) על הגנה על בעלי חיים המשמשים למטרות מדעיות. תנאים סטנדרטיים מוגדרים במתקן הדגים עם 14 שעות של אור / 10 שעות מחזור כהה ו?…

Representative Results

תוצאות ונתונים המוצגים כאן מכונים עוברי CF שנוצרו באמצעות הזרקת cftr morpholinos כמתוארקודם לכן 10 ובצעד 5. כדי לאמת את פנוטיפ CF, המיקום הלקויה של איברים פנימיים כגון לב, כבד, ולבלב כפישתואר קודם לכן 17 (איור 1) נחשבו. תוצאות דומות הושגו במקרה של עוברי WT כפ…

Discussion

בכתב יד זה, תיארנו את הפרוטוקול לבצע P. aeruginosa (PAO1) זיהום בעוברי דגי זברה ואיך ליישם טיפול phage עם קוקטייל של phages שזוהו בעבר כמסוגל להדביק PAO1 כדי לפתור את זה. השימוש bacteriophages כחלופה לטיפולים אנטיביוטיים כבר עניין גובר מאז השנים האחרונות. זה בעיקר בשל דיפוזיה של זיהומים חיידקיים עמידים לתרו?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי קרן סיסטיק פיברוזיס האיטלקית (FFC#22/2017; אסוציאציה “גלי אצ’י דלה ריטי” קסניגו ו-FFC#23/2019; האו”ם respiro בפיו Onlus La Mano tesa Onlus).

Materials

Bacto Agar BD 214010
Calcium chloride Sigma-Aldrich 10043-52-4
CsCl Sigma-Aldrich 289329
Dulbecco's phospate buffered saline PBS Sigma-Aldrich D8537
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate Sigma-Aldrich 886-86-2 common name tricaine
Femtojet Micromanipulator Eppendorf 5247
Fleming/brown P-97 Sutter Instrument Company P-97
LE-Agarose Sigma-Aldrich 11685660001
Low Melting Agarose Sigma-Aldrich CAS 9012-36-6
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich 7487-88-9
Methyl Blue Sigma-Aldrich 28983-56-4
Microinjection needles Harvard apparatus
N-Phenylthiourea >=98% Aldrich-P7629 103-85-5
Oligo Morpholino Gene Tools designed by the researcher
PEG6000 Calbiochem 528877
Phenol Red Solution Sigma-Aldrich CAS 143-74-B
Potassium chloride Sigma-Aldrich 7447-40-7
Pronase Sigma-Aldrich 9036-06-0
Sodium chloride ACS reagent, ≥99.0% Sigma-Aldrich S9888
Stereomicroscope Leica S9I
Tris HCl Sigma-Aldrich T5941
Triton X Sigma-Aldrich T9284
Tryptone Oxoid LP0042B
Yeast extract Oxoid LP0021B
Z-MOLDS Microinjection Word Precision Instruments

References

  1. Cisek, A. A., Dąbrowska, I., Gregorczyk, K. P., Wyżewski, Z. Phage Therapy in Bacterial Infections Treatment: One Hundred Years After the Discovery of Bacteriophages. Current Microbiology. 74 (2), 277-283 (2017).
  2. Trend, S., Fonceca, A. M., Ditcham, W. G., Kicic, A., Cf, A. The potential of phage therapy in cystic fibrosis: Essential human-bacterial-phage interactions and delivery considerations for use in Pseudomonas aeruginosa-infected airways. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (6), 663-667 (2017).
  3. Pacios, O., et al. Strategies to combat multidrug-resistant and persistent infectious diseases. Antibiotics. 9 (2), 65 (2020).
  4. Dubos, R. J., Straus, J. H., Pierce, C. The multiplication of bacteriophage in vivo and its protective effect against an experimental infection with shigella dysenteriae. Journal of Experimental Medicine. 78 (3), 161-168 (1943).
  5. Marza, J. A. S., Soothill, J. S., Boydell, P., Collyns, T. A. Multiplication of therapeutically administered bacteriophages in Pseudomonas aeruginosa infected patients. Burns. 32 (5), 644-656 (2006).
  6. Heo, Y. J., et al. Antibacterial efficacy of phages against Pseudomonas aeruginosa infections in mice and Drosophila melanogaster. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 01646 (2009).
  7. McVay, C. S., Velásquez, M., Fralick, J. A. Phage therapy of Pseudomonas aeruginosa infection in a mouse burn wound model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 01028 (2007).
  8. Forti, F., et al. Design of a broad-range bacteriophage cocktail that reduces Pseudomonas aeruginosa biofilms and treats acute infections in two animal models. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 02573 (2018).
  9. Jault, P., et al. Efficacy and tolerability of a cocktail of bacteriophages to treat burn wounds infected by Pseudomonas aeruginosa (PhagoBurn): a randomised, controlled, double-blind phase 1/2 trial. Lancet Infectious Diseases. 19 (1), 35-45 (2019).
  10. Phennicie, R. T., Sullivan, M. J., Singer, J. T., Yoder, J. A., Kim, C. H. Specific resistance to Pseudomonas aeruginosa infection in zebrafish is mediated by the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Infections and Immunity. 78, 4542-4550 (2010).
  11. Clatworthy, A. E., et al. Pseudomonas aeruginosa infection of zebrafish involves both host and pathogen determinants. Infections and Immunity. 77, 1293-1303 (2009).
  12. Bernut, A., et al. CFTR Protects against Mycobacterium abscessus Infection by Fine-Tuning Host Oxidative Defenses. Cell Reports. 26 (7), 1828-1840 (2019).
  13. Semler, D. D., Goudie, A. D., Finlay, W. H., Dennis, J. J. Aerosol phage therapy efficacy in Burkholderia cepacia complex respiratory infections. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 02388 (2014).
  14. Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).
  15. Doring, G., Gulbins, E. Cystic fibrosis and innate immunity: how chloride channel mutations provoke lung disease. Cellular Microbiology. 11, 208-216 (2009).
  16. Navis, A., Bagnat, M. Loss of cftr function leads to pancreatic destruction in larval zebrafish. Developmental Biology. 399, 237-248 (2015).
  17. Navis, A., Marjoram, L., Bagnat, M. Cftr controls lumen expansion and function of Kupffer’s vesicle in zebrafish. Development. 140, 1703-1712 (2013).
  18. Balloy, V., et al. Normal and cystic fibrosis human bronchial epithelial cells infected with Pseudomonas aeruginosa exhibit distinct gene activation patterns. PLoS One. 10, 0140979 (2015).
  19. Cafora, M., et al. Phage therapy against Pseudomonas aeruginosa infections in a cystic fibrosis zebrafish model. Science Reports. 9, 1527 (2019).
  20. Hershey, A. D., Kalmanson, G. M., Bronfenbrenner, J. Quantitative methods in the study of the phage-antiphage reaction. Journal of Immunology. 46, 267-279 (1943).
  21. Kimmel, C., Ballard, W., Kimmel, S., Ullmann, B., Schilling, T. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
  22. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
  23. Traver, D., et al. The Zebrafish as a Model Organism to Study Development of the Immune System. Advances in Immunology. 81, 253-330 (2003).

Play Video

Cite This Article
Cafora, M., Forti, F., Briani, F., Ghisotti, D., Pistocchi, A. Phage Therapy Application to Counteract Pseudomonas aeruginosa Infection in Cystic Fibrosis Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (159), e61275, doi:10.3791/61275 (2020).

View Video