Summary

Фаг терапии Применение для противодействия Pseudomonas aeruginosa инфекции в муковисцидоз Зебрафиш Эмбрионы

Published: May 12, 2020
doi:

Summary

Представлено здесь протокол для Pseudomonas aeruginosa инфекции и фаг терапии применения в муковисцидоз (CF) эмбрионов зебры.

Abstract

Устойчивость к противомикробным препаратам, которое является одним из основных следствий диагностической неопределенности и чрезмерной предписания противомикробных препаратов, является все более признанной причиной тяжелых инфекций, осложнений и смертности во всем мире, что оказывает огромное воздействие на наше общество и систему здравоохранения. В частности, пациенты с ослабленной иммунной системой или уже существующими и хроническими патологиями, такими как муковисцидоз (CF), подвергаются частым антибиотикам для борьбы с инфекциями с появлением и распространением мультирезистентных изолятов. Поэтому существует настоятельная необходимость в решении альтернативных методов лечения для противодействия бактериальным инфекциям. Использование бактериофагов, естественных врагов бактерий, может быть возможным решением. Протокол, подробно описанный в этой работе, описывает применение фаговой терапии против инфекции Pseudomonas aeruginosa в эмбрионах зебры. Эмбрионы зебры были инфицированы P. aeruginosa, чтобы продемонстрировать, что фаг-терапия эффективна против инфекций P. aeruginosa, поскольку она снижает летальность, бактериальное бремя и провоспалительный иммунный ответ в эмбрионах CF.

Introduction

Фаге терапии, использование естественных врагов бактерий для борьбы с бактериальными инфекциями, набирает новый интерес, как бактериальная устойчивость к антибиотикамстановится широко распространенным 1,2. Эта терапия, используемая в течение десятилетий в Восточной Европе, можно считать дополнительным лечением антибиотиков в лечении легочных инфекций у пациентов с CF и возможной терапевтической альтернативой для пациентов, инфицированных бактериями, которые устойчивы ко всем используемым в настоящее времяантибиотикам 2,3. Преимущества антибиотикотерапии в том, что бактериофагы размножаются на месте инфекции, в то время как антибиотики метаболизируются ивыбывают из организма 4,,5. Действительно, администрирование коктейлей вирулентных фагов, изолированных в различных лабораториях, оказалось эффективным в лечении инфекций Pseudomonas aeruginosa в животных моделях, таких как насекомыеи млекопитающие 6,7,8. Фаге терапии было также показано, чтобы быть в состоянии уменьшить бактериальную нагрузку в ожоговых ран, инфицированных P. aeruginosa и Escherichia coli в рандомизированных клиническихиспытаний 9.

Зебрафиш(Danio rerio) недавно стала ценной моделью для изучения инфекций с несколькими патогенами, в том числе P. aeruginosa10,11, Mycobacterium abscessus и Burkolderia cepacia12,13. Путем микроинъекций бактерий сразу вциркуляцию крови зародыша 14 легко установить системную инфекцию которая противодействована зебрафиш врожденной иммунной системой, которая эволюционирована сохранена с нейтрофилами и поколением макрофагов подобно к людским двойнику. Кроме того, в течение первого месяца жизни эмбрионы зебры не имеют адаптивного иммунного ответа, что делает их идеальными моделями для изучения врожденного иммунитета, который является критическим защитным механизмом в легочныхинфекциях человека 15. Зебрафиш недавно появилась как мощная генетическая модель системы, чтобы лучше понять начало CF и разработать новыефармакологические методы лечения 10,,16,17. CF зебрафиш модель cftr нокдаун генерируется с морфолино инъекции в зебрафиш представил смоченной реакции респираторного всплеска и снижениемиграции нейтрофилов 10, в то время как cftr нокаут приводит к нарушению внутреннего положения органа и разрушение экзокринной поджелудочной железы, фенотип, которыйотражает болезни человека 16,17. Наибольший интерес представляет вывод о том, что бактериальная нагрузка P. aeruginosa была значительно выше в cftr-потеря-функции эмбрионов, чем в контроле на 8 часов после заражения (hpi), который параллели результаты, полученные с мышами и человека бронхиальных эпителиальныхклеток 2,18. cftr

В этой работе мы демонстрируем, что фаг-терапия эффективна против инфекций P. aeruginosa у эмбрионов зебры.

Protocol

Взрослые зебры(Danio rerio) из штамма AB (Европейский ресурсный центр Зебрафиш E’RC) поддерживаются в соответствии с международными (Директива ЕС 2010/63/EU) и национальными руководящими принципами(итальянский указ от 4 марта 2014 года, n. 26) о защите животных, используемых в научных целях. Ст…

Representative Results

Результаты и цифры, представленные здесь, ссылаются на эмбрионы CF, генерируемые путем инъекции cftr morpholinos,как описано ранее 10 и в шаге 5. Для проверки фенотипа CF были рассмотрены нарушения положения внутренних органов, таких как сердце, печень иподжелудочная же…

Discussion

В этой рукописи мы описали протокол для выполнения P. aeruginosa (PAO1) инфекции в эмбрионах зебры и как применять фаг терапии с коктейлем фагов ранее определены как способные заразить PAO1, чтобы решить ее. Использование бактериофагов в качестве альтернативы лечению антибиотиками представ…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Итальянским фондом муковисцидоза (FFC No22/2017; Ассоциазионе “Gli amici della Ritty” Casnigo и FFC No23/2019; Un respiro в Пио Онлус Ла Мано теса Онлус).

Materials

Bacto Agar BD 214010
Calcium chloride Sigma-Aldrich 10043-52-4
CsCl Sigma-Aldrich 289329
Dulbecco's phospate buffered saline PBS Sigma-Aldrich D8537
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate Sigma-Aldrich 886-86-2 common name tricaine
Femtojet Micromanipulator Eppendorf 5247
Fleming/brown P-97 Sutter Instrument Company P-97
LE-Agarose Sigma-Aldrich 11685660001
Low Melting Agarose Sigma-Aldrich CAS 9012-36-6
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich 7487-88-9
Methyl Blue Sigma-Aldrich 28983-56-4
Microinjection needles Harvard apparatus
N-Phenylthiourea >=98% Aldrich-P7629 103-85-5
Oligo Morpholino Gene Tools designed by the researcher
PEG6000 Calbiochem 528877
Phenol Red Solution Sigma-Aldrich CAS 143-74-B
Potassium chloride Sigma-Aldrich 7447-40-7
Pronase Sigma-Aldrich 9036-06-0
Sodium chloride ACS reagent, ≥99.0% Sigma-Aldrich S9888
Stereomicroscope Leica S9I
Tris HCl Sigma-Aldrich T5941
Triton X Sigma-Aldrich T9284
Tryptone Oxoid LP0042B
Yeast extract Oxoid LP0021B
Z-MOLDS Microinjection Word Precision Instruments

References

  1. Cisek, A. A., Dąbrowska, I., Gregorczyk, K. P., Wyżewski, Z. Phage Therapy in Bacterial Infections Treatment: One Hundred Years After the Discovery of Bacteriophages. Current Microbiology. 74 (2), 277-283 (2017).
  2. Trend, S., Fonceca, A. M., Ditcham, W. G., Kicic, A., Cf, A. The potential of phage therapy in cystic fibrosis: Essential human-bacterial-phage interactions and delivery considerations for use in Pseudomonas aeruginosa-infected airways. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (6), 663-667 (2017).
  3. Pacios, O., et al. Strategies to combat multidrug-resistant and persistent infectious diseases. Antibiotics. 9 (2), 65 (2020).
  4. Dubos, R. J., Straus, J. H., Pierce, C. The multiplication of bacteriophage in vivo and its protective effect against an experimental infection with shigella dysenteriae. Journal of Experimental Medicine. 78 (3), 161-168 (1943).
  5. Marza, J. A. S., Soothill, J. S., Boydell, P., Collyns, T. A. Multiplication of therapeutically administered bacteriophages in Pseudomonas aeruginosa infected patients. Burns. 32 (5), 644-656 (2006).
  6. Heo, Y. J., et al. Antibacterial efficacy of phages against Pseudomonas aeruginosa infections in mice and Drosophila melanogaster. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 01646 (2009).
  7. McVay, C. S., Velásquez, M., Fralick, J. A. Phage therapy of Pseudomonas aeruginosa infection in a mouse burn wound model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 01028 (2007).
  8. Forti, F., et al. Design of a broad-range bacteriophage cocktail that reduces Pseudomonas aeruginosa biofilms and treats acute infections in two animal models. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 02573 (2018).
  9. Jault, P., et al. Efficacy and tolerability of a cocktail of bacteriophages to treat burn wounds infected by Pseudomonas aeruginosa (PhagoBurn): a randomised, controlled, double-blind phase 1/2 trial. Lancet Infectious Diseases. 19 (1), 35-45 (2019).
  10. Phennicie, R. T., Sullivan, M. J., Singer, J. T., Yoder, J. A., Kim, C. H. Specific resistance to Pseudomonas aeruginosa infection in zebrafish is mediated by the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Infections and Immunity. 78, 4542-4550 (2010).
  11. Clatworthy, A. E., et al. Pseudomonas aeruginosa infection of zebrafish involves both host and pathogen determinants. Infections and Immunity. 77, 1293-1303 (2009).
  12. Bernut, A., et al. CFTR Protects against Mycobacterium abscessus Infection by Fine-Tuning Host Oxidative Defenses. Cell Reports. 26 (7), 1828-1840 (2019).
  13. Semler, D. D., Goudie, A. D., Finlay, W. H., Dennis, J. J. Aerosol phage therapy efficacy in Burkholderia cepacia complex respiratory infections. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 02388 (2014).
  14. Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).
  15. Doring, G., Gulbins, E. Cystic fibrosis and innate immunity: how chloride channel mutations provoke lung disease. Cellular Microbiology. 11, 208-216 (2009).
  16. Navis, A., Bagnat, M. Loss of cftr function leads to pancreatic destruction in larval zebrafish. Developmental Biology. 399, 237-248 (2015).
  17. Navis, A., Marjoram, L., Bagnat, M. Cftr controls lumen expansion and function of Kupffer’s vesicle in zebrafish. Development. 140, 1703-1712 (2013).
  18. Balloy, V., et al. Normal and cystic fibrosis human bronchial epithelial cells infected with Pseudomonas aeruginosa exhibit distinct gene activation patterns. PLoS One. 10, 0140979 (2015).
  19. Cafora, M., et al. Phage therapy against Pseudomonas aeruginosa infections in a cystic fibrosis zebrafish model. Science Reports. 9, 1527 (2019).
  20. Hershey, A. D., Kalmanson, G. M., Bronfenbrenner, J. Quantitative methods in the study of the phage-antiphage reaction. Journal of Immunology. 46, 267-279 (1943).
  21. Kimmel, C., Ballard, W., Kimmel, S., Ullmann, B., Schilling, T. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
  22. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
  23. Traver, D., et al. The Zebrafish as a Model Organism to Study Development of the Immune System. Advances in Immunology. 81, 253-330 (2003).

Play Video

Cite This Article
Cafora, M., Forti, F., Briani, F., Ghisotti, D., Pistocchi, A. Phage Therapy Application to Counteract Pseudomonas aeruginosa Infection in Cystic Fibrosis Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (159), e61275, doi:10.3791/61275 (2020).

View Video