JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Cancer Research

Ортотопическая трансплантация опухолей молочной железы как доклинические модели рака молочной железы

Published: May 18, 2020
doi:
10.3791/61173
, , , , ,
1Department of Molecular and Cellular Biology,Baylor College of Medicine, 2Lester and Sue Smith Breast Center,Baylor College of Medicine, 3Dan L. Duncan Cancer Center,Baylor College of Medicine

Summary

Модели ксенотрансплантата (PDX), полученные от пациентов, и трансплантируемые генетически модифицированные мышиные модели точно повторяют заболевание человека и являются предпочтительными моделями для фундаментальных и трансляционных исследований рака молочной железы. Здесь описан способ ортотопической трансплантации фрагментов опухоли молочной железы в жировую прокладку молочной железы для изучения биологии опухоли и оценки лекарственного ответа.

Abstract

Доклинические модели, которые точно повторяют гетерогенность опухоли и терапевтический ответ, имеют решающее значение для трансляционных исследований рака молочной железы. Увековеченные клеточные линии легко выращивать и генетически модифицировать для изучения молекулярных механизмов, но селективное давление от клеточной культуры часто приводит к генетическим и эпигенетическим изменениям с течением времени. Модели ксенотрансплантататов (PDX), полученные от пациентов, точно повторяют гетерогенность и лекарственную реакцию опухолей молочной железы человека. Модели PDX демонстрируют относительно короткую латентность после ортотопической трансплантации, что облегчает исследование биологии опухоли молочной железы и лекарственного ответа. Трансплантируемые генно-инженерные мышиные модели позволяют изучать иммунитет к опухолям молочной железы. Текущий протокол описывает метод ортотопической трансплантации фрагментов опухоли молочной железы в жировую прокладку молочной железы с последующим медикаментозным лечением. Эти доклинические модели обеспечивают ценные подходы к исследованию биологии опухоли молочной железы, лекарственного ответа, обнаружения биомаркеров и механизмов лекарственной устойчивости.

Introduction

Большинство смертей от рака молочной железы можно отнести к рецидивирующим заболеваниям, устойчивым к традиционным методамлечения 1,2. Меж- и внутриопухоляюмная гетерогенность рака молочной железы способствует резистентности к терапии. Кроме того, гетерогенность опухоли может посягнуть на точный прогноз и бросить вызов управлению заболеваниями3,4. Идентификация прогностических биомаркеров ответа позволит значительно улучшить клинические исходы пациенток с раком молочной железы. Несмотря на то, что большинство типов рака молочной железы являются иммунологически «холодными» опухолями, которые, вероятно, не реагируют на иммунотерапию, ингибиторы иммунных контрольных точек показали многообещающие результаты в клинических испытаниях2,5. Например, исследование III фазы показало улучшение выживаемости без заболевания (DFS) и предварительные доказательства того, что атезолизумаб (моноклональное антитело против PD-L1) в сочетании с наб-паклитакселом может обеспечить общее преимущество выживаемости по сравнению с наб-паклитакселом в одиночку при опухолях с окрашиванием ≥1% PD-L16. Разработка методов лечения, которые сенсибилизируют опухоли молочной железы к иммунотерапии, произведет революцию в схемах лечения.

Доклинические модели, которые точно повторяют гетерогенность рака молочной железы человека и реакцию на лекарства, имеют решающее значение для изучения биологии опухоли и выявления потенциальных биомаркеров для таргетной терапии. Увековеченные клеточные линии широко используются для исследований рака молочной железы, поскольку эти клеточные линии легко выращивать и генетически модифицировать для изучения молекулярных механизмов. Однако из-за селективного давления от долгосрочной клеточной культуры in vitro со временем может произойти генетический дрейф, и клеточные линии рака молочной железы могут нести специфические для клеточных линий геномные изменения, которые отличаются от аберраций в первичных опухолях молочной железы7,8,9.

Опухолевые куски ксенотрансплантата (PDX), полученные от пациента, способны рекапитулировать гетерогенность заболевания человека и гистологически и иммуногистохимически похожи на опухоль происхождения10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29. Важно отметить, что модели PDX фенотипически стабильны при множественных трансплантациях, о чем свидетельствуют гистология, транскриптом, протеом и геномный анализ10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29. Модели PDX показывают ответы на лечение, сопоставимые стеми,которые наблюдаются клинически10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24, 25,26,27,28,29. Были созданы модели PDX для положительных рецепторов эстрогена (ER+),положительных рецепторов прогестерона (PR+),эпидермального фактора роста 2 положительных (ERBB2+,HER2+) и тройного отрицательного рака молочной железы (TNBC) PDX и обеспечивают отличную платформу для тестирования эндокринной, химио- и таргетной терапии. Тем не менее, одним из основных предостережений моделей PDX в настоящее время является отсутствие функциональной иммунной системы у мыши.

Генетически модифицированные мышиные модели (GEMM), такие как модели сверхэкспрессии Trp53 homozygous null, cMyc, Wnt1, PyMT или Her2, позволяют изучать спонтанное инициирование, прогрессирование и метастазирование опухоли в контексте интактной иммунной системы. Однако латентность опухоли длительная, что затрудняет проведение доклинических исследований с несколькими руками30,31. Тем не менее, GEMM может быть трансплантирован сингенным хозяевам для создания достаточного количества опухолей, которые точно рекапитулируют опухоли человека32,33, 34,35,36, 37,38,39,40,41,42,43,44,45, 46,47,48,49,50,51,52,53,54,55. Например, эпителий молочной железы от p53-нулевой мыши BALB/c был пересажен в очищенные жировые подушечки сингенных мышей-реципиентов дикого типа с образованием первичных опухолей, которые могут быть дополнительно пересажены в сингенные хозяева56,57. Опухоли p53-null рекапитулировали различные подтипы опухолей человека.

Комбинация моделей PDX и трансплантируемого GEMM предоставляет ценные доклинические инструменты для изучения биологии опухоли молочной железы, лекарственного ответа и противоопухоляевого иммунитета. В действующем протоколе описан метод ортотопической трансплантации фрагментов опухолей PDX и GEMM в жировую прокладку молочной железы мыши. Эти модели поддаются последовательным прохождениям и обычно сохраняют стабильный фенотип. Чтобы снизить риск генетического дрейфа или потери гетерогенности между проходами с течением времени, несколько фрагментов ткани криоконсервируются на каждом проходе для последующей трансплантации в том случае, если биологические или морфологические изменения наблюдаются с течениемвремени 29,58.

Protocol

Все протоколы с использованием животных были рассмотрены и одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC). Фрагменты опухоли, размером около 1−2 мм3, получены из жизнеспособно замороженного запаса, полученного из ксенотрансплантата пациента и…

Representative Results

На рисунке 1 показано оборудование(рисунок 1A)и ключевые процедуры(рисунок 1B)ортотопической трансплантации. На рисунке 2 показана характеристика трансплантированной опухоли PDX (MC1). Фраг…

Discussion

Чтобы уменьшить вариации роста опухоли у животных, крайне важно разрезать опухолевую ткань на 1 мм3 фрагмента для трансплантации. С моделями, на которые растут мягкие ткани, сложнее работать, а фрагменты опухоли нужно обрезать немного больше (1−2 мм3). При помещении ткани в кар…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения (R37CA228304 и R01HL146642 Си Чену, CA148761 Джеффри М. Розену), Министерством обороны США (W81XWH-19-1-0524 для Xi Chen, W81XWH-19-1-0035 для Xiangdong Lv), Американским онкологическим обществом (RSG-18-181-01-TBE для Xi Chen) и Институтом профилактики рака и исследований рака Техаса (RR150009 CPRIT Scholar in Cancer Research Award для Xi Chen), Ксенотрансплантат, полученный от пациента, и усовершенствованное ядро моделей In Vivo в Медицинском колледже Бейлора (финансирование от RP170691 CPRIT Core Facility Award и NCI-CA125123 P30 Cancer Center Support Grant).

Materials

1 mg/mL Buprenorphine-SR ZooPharm (via BCM veterinarians) Sterile
26G syringe BD 148232E Sterile
Betadine Scrub Fisher 19-027132
Cotton Swabs VWR International Laboratory 89031-272 Sterile
DMEM Fisher MT 10-013-CM Sterile
Electric shaver Oster 78005-050
Glass beads sterilizer (Germinator) Roboz Surgical Store DS-401
Lubricant ophthalmic ointment Akorn Animal Health 17478-062-35
Micro Dissecting Forceps; Serrated, Angular (regular forceps) Roboz Surgical Store RS-5139 Sterile
Micro Dissecting Spring Scissors (fat pad cutter) Roboz Surgical Store RS-5658BT Sterile
Micro Forceps (tissue placing forceps) Roboz Surgical Store RS-5069 Sterile
Petri Dish Fisher 08-757- 100D Sterile
Sterile drape Sai Infusion Technology PSS-SD1 Sterile
Surgery scissors Roboz Surgical Store RS-5960 Sterile
Tissue Forceps (claw forceps) Roboz Surgical Store RS-5158 Sterile
Wound clip applier BD Autoclip Wound System 01-804 Sterile
Wound clip remover BD Autoclip Wound System 01-804-15 Sterile
Wound clips BD Autoclip Wound System 01-804-5 Sterile
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Waks, A. G., Winer, E. P. Breast Cancer Treatment: A Review. JAMA. 321 (3), 288-300 (2019).
  2. Harbeck, N., et al. Breast cancer. Nature Reviews Disease Primers. 5 (1), 66 (2019).
  3. Harbeck, N., Salem, M., Nitz, U., Gluz, O., Liedtke, C. Personalized treatment of early-stage breast cancer: present concepts and future directions. Cancer Treatment Reviews. 36 (8), 584-594 (2010).
  4. Zardavas, D., Irrthum, A., Swanton, C., Piccart, M. Clinical management of breast cancer heterogeneity. Nature Reviews Clinical Oncology. 12 (7), 381 (2015).
  5. Esteva, F. J., Hubbard-Lucey, V. M., Tang, J., Pusztai, L. Immunotherapy and targeted therapy combinations in metastatic breast cancer. The Lancet Oncology. 20 (3), e175-e186 (2019).
  6. Schmid, P., et al. Atezolizumab and nab-paclitaxel in advanced triple-negative breast cancer. New England Journal of Medicine. 379 (22), 2108-2121 (2018).
  7. Tsuji, K., et al. Breast cancer cell lines carry cell line-specific genomic alterations that are distinct from aberrations in breast cancer tissues: comparison of the CGH profiles between cancer cell lines and primary cancer tissues. BMC Cancer. 10 (1), 15 (2010).
  8. Neve, R. M., et al. A collection of breast cancer cell lines for the study of functionally distinct cancer subtypes. Cancer Cell. 10 (6), 515-527 (2006).
  9. Clarke, R. Human breast cancer cell line xenografts as models of breast cancer-the immunobiologies of recipient mice and the characteristics of several tumorigenic cell lines. Breast Cancer Research and Treatment. 39 (1), 69-86 (1996).
  10. DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17 (11), 1514 (2011).
  11. Kuperwasser, C., et al. Reconstruction of functionally normal and malignant human breast tissues in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America of the United States of America. 101 (14), 4966-4971 (2004).
  12. Vaillant, F., et al. Targeting BCL-2 with the BH3 mimetic ABT-199 in estrogen receptor-positive breast cancer. Cancer Cell. 24 (1), 120-129 (2013).
  13. Li, S., et al. Endocrine-therapy-resistant ESR1 variants revealed by genomic characterization of breast-cancer-derived xenografts. Cell Reports. 4 (6), 1116-1130 (2013).
  14. DeRose, Y. S., et al. Patient-derived models of human breast cancer: protocols for in vitro and in vivo applications in tumor biology and translational medicine. Current Protocols in Pharmacology. 60 (1), 14.23.11-14.23.43 (2013).
  15. Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
  16. Marangoni, E., et al. A new model of patient tumor-derived breast cancer xenografts for preclinical assays. Clinical Cancer Research. 13 (13), 3989-3998 (2007).
  17. Zhang, H., et al. Patient-derived xenografts of triple-negative breast cancer reproduce molecular features of patient tumors and respond to mTOR inhibition. Breast Cancer Research. 16 (2), R36 (2014).
  18. Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature Reviews Immunology. 7 (2), 118 (2007).
  19. Sheffield, L. G., Welsch, C. W. Transplantation of human breast epithelia to mammary-gland-free fat-pads of athymic nude mice: Influence of mammotrophic hormones on growth of breast epithelia. International Journal of Cancer. 41 (5), 713-719 (1988).
  20. Sebesteny, A., et al. Primary human breast carcinomas transplantable in the nude mouse. Journal of the National Cancer Institute. 63 (6), 1331-1337 (1979).
  21. Sakakibara, T., et al. Growth and metastasis of surgical specimens of human breast carcinomas in SCID mice. The Cancer Journal from Scientific American. 2 (5), 291-300 (1996).
  22. Rae-Venter, B., Reid, L. M. Growth of human breast carcinomas in nude mice and subsequent establishment in tissue culture. Cancer Research. 40 (1), 95-100 (1980).
  23. Outzen, H., Custer, R. Brief communication: Growth of human normal and neoplastic mammary tissues in the cleared mammary fat pad of the nude mouse. Journal of the National Cancer Institute. 55 (6), 1461-1466 (1975).
  24. Noël, A., et al. Heterotransplantation of primary and established human tumour cells in nude mice. Anticancer Research. 15 (1), 1-7 (1995).
  25. Naundorf, H., Fichtner, I., Büttner, B., Frege, J. Establishment and characterization of a new human oestradiol-and progesterone-receptor-positive mammary carcinoma serially transplantable in nude mice. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 119 (1), 35-40 (1992).
  26. Murthy, M. S., Scanlon, E. F., Jelachich, M. L., Klipstein, S., Goldschmidt, R. A. Growth and metastasis of human breast cancers in athymic nude mice. Clinical and Experimental Metastasis. 13 (1), 3-15 (1995).
  27. Fichtner, I., Becker, M., Zeisig, R., Sommer, A. In vivo models for endocrine-dependent breast carcinomas: special considerations of clinical relevance. European Journal of Cancer. 40 (6), 845-851 (2004).
  28. Ding, L., et al. Genome remodelling in a basal-like breast cancer metastasis and xenograft. Nature. 464 (7291), 999 (2010).
  29. Zhang, X., et al. A renewable tissue resource of phenotypically stable, biologically and ethnically diverse, patient-derived human breast cancer xenograft models. Cancer Research. 73 (15), 4885-4897 (2013).
  30. Borowsky, A. D. Choosing a mouse model: experimental biology in context-the utility and limitations of mouse models of breast cancer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (9), a009670 (2011).
  31. Caligiuri, I., Rizzolio, F., Boffo, S., Giordano, A., Toffoli, G. Critical choices for modeling breast cancer in transgenic mouse models. Journal of Cellular Physiology. 227 (8), 2988-2991 (2012).
  32. Backlund, M. G., et al. Impact of ionizing radiation and genetic background on mammary tumorigenesis in p53-deficient mice. Cancer Research. 61 (17), 6577-6582 (2001).
  33. Jerry, D., et al. A mammary-specific model demonstrates the role of the p53 tumor suppressor gene in tumor development. Oncogene. 19 (8), 1052-1058 (2000).
  34. Hüsler, M. R., et al. Lactation-induced WAP-SV40 Tag transgene expression in C57BL/6J mice leads to mammary carcinoma. Transgenic Research. 7 (4), 253-263 (1998).
  35. Simin, K., et al. pRb inactivation in mammary cells reveals common mechanisms for tumor initiation and progression in divergent epithelia. PLoS Biology. 2 (2), e22 (2004).
  36. Sandgren, E. P., et al. Inhibition of mammary gland involution is associated with transforming growth factor α but not c-myc-induced tumorigenesis in transgenic mice. Cancer Research. 55 (17), 3915-3927 (1995).
  37. Gallahan, D., et al. Expression of a truncated Int3 gene in developing secretory mammary epithelium specifically retards lobular differentiation resulting in tumorigenesis. Cancer Research. 56 (8), 1775-1785 (1996).
  38. Tsukamoto, A. S., Grosschedl, R., Guzman, R. C., Parslow, T., Varmus, H. E. Expression of the int-1 gene in transgenic mice is associated with mammary gland hyperplasia and adenocarcinomas in male and female mice. Cell. 55 (4), 619-625 (1988).
  39. Guy, C. T., Cardiff, R., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).
  40. Guy, C. T., et al. Expression of the neu protooncogene in the mammary epithelium of transgenic mice induces metastatic disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (22), 10578-10582 (1992).
  41. Xu, X., et al. Conditional mutation of Brca1 in mammary epithelial cells results in blunted ductal morphogenesis and tumour formation. Nature Genetics. 22 (1), 37 (1999).
  42. Maroulakou, I. G., Anver, M., Garrett, L., Green, J. E. Prostate and mammary adenocarcinoma in transgenic mice carrying a rat C3 (1) simian virus 40 large tumor antigen fusion gene. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (23), 11236-11240 (1994).
  43. Yin, Y., et al. Characterization of medroxyprogesterone and DMBA-induced multilineage mammary tumors by gene expression profiling. Molecular Carcinogenesis. 44 (1), 42-50 (2005).
  44. Cressman, V. L., et al. Mammary tumor formation in p53-and BRCA1-deficient mice. Cell Growth and Differentiation-Publication American Association for Cancer Research. 10 (1), 1-10 (1999).
  45. Li, Z., et al. ETV6-NTRK3 fusion oncogene initiates breast cancer from committed mammary progenitors via activation of AP1 complex. Cancer Cell. 12 (6), 542-558 (2007).
  46. Pond, A. C., et al. Fibroblast growth factor receptor signaling dramatically accelerates tumorigenesis and enhances oncoprotein translation in the mouse mammary tumor virus-Wnt-1 mouse model of breast cancer. Cancer Research. 70 (12), 4868-4879 (2010).
  47. Sinn, E., et al. Coexpression of MMTV/v-Ha-ras and MMTV/c-myc genes in transgenic mice: synergistic action of oncogenes in vivo. Cell. 49 (4), 465-475 (1987).
  48. Muller, W. J., et al. The int-2 gene product acts as an epithelial growth factor in transgenic mice. The EMBO Journal. 9 (3), 907-913 (1990).
  49. Liu, S., et al. Expression of autotaxin and lysophosphatidic acid receptors increases mammary tumorigenesis, invasion, and metastases. Cancer Cell. 15 (6), 539-550 (2009).
  50. Torres-Arzayus, M. I., et al. High tumor incidence and activation of the PI3K/AKT pathway in transgenic mice define AIB1 as an oncogene. Cancer Cell. 6 (3), 263-274 (2004).
  51. Chan, S. R., et al. STAT1-deficient mice spontaneously develop estrogen receptor α-positive luminal mammary carcinomas. Breast Cancer Research. 14 (1), R16 (2012).
  52. Jiang, Z., et al. Rb deletion in mouse mammary progenitors induces luminal-B or basal-like/EMT tumor subtypes depending on p53 status. The Journal of Clinical Investigation. 120 (9), 3296-3309 (2010).
  53. Adams, J. R., et al. Cooperation between Pik3ca and p53 mutations in mouse mammary tumor formation. Cancer Research. 71 (7), 2706-2717 (2011).
  54. Pei, X. H., et al. CDK inhibitor p18INK4c is a downstream target of GATA3 and restrains mammary luminal progenitor cell proliferation and tumorigenesis. Cancer Cell. 15 (5), 389-401 (2009).
  55. Bultman, S., et al. Characterization of mammary tumors from Brg1 heterozygous mice. Oncogene. 27 (4), 460 (2008).
  56. Jerry, D., et al. A mammary-specific model demonstrates the role of the p53 tumor suppressor gene in tumor development. Oncogene. 19 (8), 1052 (2000).
  57. Zhang, M., et al. Identification of tumor-initiating cells in a p53-null mouse model of breast cancer. Cancer Research. 68 (12), 4674-4682 (2008).
  58. Landis, M. D., Lehmann, B. D., Pietenpol, J. A., Chang, J. C. Patient-derived breast tumor xenografts facilitating personalized cancer therapy. Breast Cancer Research. 15 (1), 201 (2013).
  59. Zhang, X., Lewis, M. T. Establishment of Patient-Derived Xenograft (PDX) Models of Human Breast Cancer. Current Protocols in Mouse Biology. 3 (1), 21-29 (2013).
  60. Chi, V., Chandy, K. G. Immunohistochemistry: paraffin sections using the Vectastain ABC kit from vector labs. Journal of Visualized Experiments. (8), e308 (2007).
  61. Zhao, N., et al. Pharmacological targeting of MYC-regulated IRE1/XBP1 pathway suppresses MYC-driven breast cancer. Journal of Clinical Investigation. 128 (4), 1283-1299 (2018).
  62. DeOme, K., Faulkin, L., Bern, H. A., Blair, P. B. Development of mammary tumors from hyperplastic alveolar nodules transplanted into gland-free mammary fat pads of female C3H mice. Cancer Research. 19 (5), 515 (1959).

Tags

Orthotopic TransplantationBreast TumorPreclinical ModelBreast CancerTumor BiologyDrug ResponseDrug ResistanceMammary Fat PadPatient-derived XenograftSubcutaneous ImplantationCryopreservationThawingTumor DissectionDMEM

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Lv, X., Dobrolecki, L. E., Ding, Y., Rosen, J. M., Lewis, M. T., Chen, X. Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer. J. Vis. Exp. (159), e61173, doi:10.3791/61173 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image