Transplante Ortotópico de Tumores mamários como Modelos Pré-Clínicos para o Câncer de Mama

Summary

Modelos de xenoenxerto derivados da paciente (PDX) e modelos transplantáveis de camundongos geneticamente modificados recapitulam fielmente a doença humana e são modelos preferidos para pesquisas básicas e translacionais sobre câncer de mama. Aqui, um método é descrito para transplantar ortotopicamente fragmentos de tumor de mama na almofada de gordura mamária para estudar biologia tumoral e avaliar a resposta medicamentosa.

Abstract

Modelos pré-clínicos que recapitulam fielmente a heterogeneidade tumoral e a resposta terapêutica são fundamentais para a pesquisa translacional do câncer de mama. Linhas celulares imortalizadas são fáceis de cultivar e geneticamente modificadas para estudar mecanismos moleculares, mas a pressão seletiva da cultura celular muitas vezes leva a alterações genéticas e epigenéticas ao longo do tempo. Modelos de xenoenxerto derivados da paciente (PDX) recapitulam fielmente a heterogeneidade e a resposta medicamentosa de tumores mamários humanos. Os modelos PDX exibem uma latência relativamente curta após o transplante ortotópico que facilita a investigação da biologia do tumor de mama e da resposta a medicamentos. Os modelos transplantáveis de camundongos geneticamente modificados permitem o estudo da imunidade do tumor de mama. O protocolo atual descreve o método para transplantar ortotopicamente fragmentos de tumor de mama na almofada de gordura mamária seguido de tratamentos medicamentosos. Esses modelos pré-clínicos fornecem abordagens valiosas para investigar a biologia do tumor de mama, a resposta a medicamentos, a descoberta de biomarcadores e os mecanismos de resistência a medicamentos.

Introduction

A maioria das mortes por câncer de mama pode ser atribuída a doenças recorrentes resistentes às terapias convencionais^1,2. A heterogeneidade inter e intra-tumora dos cânceres de mama contribuem para a resistência terapêutica. Além disso, a heterogeneidade tumoral pode afetar o prognóstico preciso e desafiar o manejo da doença^3,4. A identificação de biomarcadores preditivos de resposta melhorará significativamente os resultados clínicos de pacientes com câncer de mama. Embora a maioria dos tipos de câncer de mama sejam tumores imunologicamente ‘frios’ que provavelmente não são responder à imunoterapia, os inibidores de checkpoint imunológicos têm mostrado promessa nos ensaios clínicos^2,5. Por exemplo, um estudo de fase III mostrou melhor sobrevida livre de doenças (DFS) e evidências preliminares de que o atezolizumabe (anticorpo monoclonal contra PD-L1) combinado com nab-paclitaxel pode fornecer um benefício global de sobrevivência em comparação com nab-paclitaxel sozinho em tumores com ≥1% de mancha PD-L1⁶. O desenvolvimento de terapias que sensibilizem tumores mamários para a imunoterapia revolucionará os regimes de tratamento.

Modelos pré-clínicos que recapitulam fielmente a heterogeneidade do câncer de mama humano e a resposta a medicamentos são fundamentais para estudar a biologia tumoral e identificar potenciais biomarcadores para terapia direcionada. As linhas celulares imortalizadas são amplamente utilizadas para pesquisas sobre câncer de mama, uma vez que essas linhas celulares são fáceis de crescer e geneticamente modificadas para estudar mecanismos moleculares. No entanto, devido à pressão seletiva da cultura celular de longo prazo in vitro, a deriva genética pode ocorrer ao longo do tempo e as linhas de células cancerígenas de mama podem levar a alterações genômicas específicas da linha celular que são distintas das aberrações em tumores primários de mama^7,8,9.

Os pedaços tumorais de xenoenxerto derivados do paciente (PDX) são capazes de recapitular a heterogeneidade da doença humana, e são histologicamente e imunohistoquesticamente semelhantes ao tumor de origem^{10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29}. É importante ressaltar que os modelos PDX são fenotipicamente estáveis em múltiplos transplantes, evidenciados pela histologia, transcriptome, proteome e análise genômica^{10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29}. Os modelos PDX mostram respostas de tratamento comparáveis às observadas clinicamente^{10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24, 25,26,27,28,29}. Foram estabelecidos modelos PDX para os modelos PDX positivos para receptor de estrogênio (ER^+),receptor de progesterona positivo (PR^+),fator de crescimento epidérmico 2 positivo (ERBB2⁺, HER2⁺) e câncer de mama triplo negativo (TNBC) modelos PDX e fornecem uma excelente plataforma para testar terapias endócrinas, quimio e direcionadas. No entanto, uma das principais ressalvas dos modelos PDX no momento é a falta de um sistema imunológico funcional no mouse.

Os modelos de rato geneticamente modificados (GEMM), como trp53 homozigos nulos, cMyc, Wnt1, PyMT, ou modelos de superexpressão Her2, permitem o estudo da iniciação espontânea do tumor, progressão e metástase no contexto de um sistema imunológico intacto. No entanto, a latência tumoral é longa, o que dificulta a realização de ensaios pré-clínicos com múltiplos braços^30,31. No entanto, o GEMM pode ser transplantado para hospedeiros síngênicos para gerar número suficiente de tumores que recapitulem de perto tumores humanos^{32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45, 46,47,48,49,50,51,52,53,54,55}. Por exemplo, o epitélio mamário de um rato BALB/c p53-nulo foi transplantado nas almofadas de gordura limpas de camundongos receptores do tipo selvagem síndico para formar tumores primários, que podem ser transplantados ainda mais em hospedeiros síngênicos^56,57. Os tumores p53-nulos recapitularam diferentes subtipos de tumores humanos.

A combinação de modelos PDX e GEMM transplantável fornece ferramentas pré-clínicos valiosas para investigar a biologia do tumor de mama, a resposta a medicamentos e a imunidade anti-tumor. No protocolo atual, é descrito um método de transplante ortotópico de fragmentos de tumor PDX e GEMM na almofada de gordura mamária do rato. Estes modelos são passíveis de passagens seriais e geralmente mantêm um fenótipo estável. Para mitigar o risco de deriva genética ou perda de heterogeneidade através de passagens ao longo do tempo, múltiplos fragmentos de tecido são criopreservados a cada passagem para transplante subsequente no caso de alterações biológicas ou morfológicas serem observadas ao longo do tempo^29,58.

Protocol

Todos os protocolos de uso de animais foram revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC). Os fragmentos tumorais, com cerca de1-2 mm de tamanho, são de estoque viávelmente congelado obtido do Xenoenxerto Derivado do Paciente e núcleo avançado de modelos In Vivo na Baylor College of Medicine. 1. Preparação de fragmentos de tumor mamário criopreservados para transplante Transfira o criovial com fragmentos tumorais de nitrogêni…

Representative Results

A Figura 1 mostra os equipamentos (Figura 1A) e procedimentos-chave(Figura 1B) de transplante ortotópico. A Figura 2 mostra a caracterização de um tumor PDX transplantado (MC1). Fragmentos tumorais (1 mm3) do modelo MC1 foram transplantados na almofada de gordura #4 de camundongos SCID/Bege. Um mês depois, o tamanho médio…

Discussion

Para reduzir as variações no crescimento do tumor entre os animais, é fundamental cortar o tecido tumoral em fragmentos de 1 mm³ para transplante. Modelos que crescem tecido mole são mais difíceis de trabalhar e os fragmentos tumorais precisam ser cortados ligeiramente maiores (1−2 mm³). Ao colocar o tecido no bolso da almofada de gordura mamária tome cuidado para não dividir o tecido em vários pedaços, pois isso resultará em múltiplos tumores pequenos ou tumores de forma estranha.

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Materials

1 mg/mL Buprenorphine-SR	ZooPharm (via BCM veterinarians)		Sterile
26G syringe	BD	148232E	Sterile
Betadine Scrub	Fisher	19-027132
Cotton Swabs	VWR International Laboratory	89031-272	Sterile
DMEM	Fisher	MT 10-013-CM	Sterile
Electric shaver	Oster	78005-050
Glass beads sterilizer (Germinator)	Roboz Surgical Store	DS-401
Lubricant ophthalmic ointment	Akorn Animal Health	17478-062-35
Micro Dissecting Forceps; Serrated, Angular (regular forceps)	Roboz Surgical Store	RS-5139	Sterile
Micro Dissecting Spring Scissors (fat pad cutter)	Roboz Surgical Store	RS-5658BT	Sterile
Micro Forceps (tissue placing forceps)	Roboz Surgical Store	RS-5069	Sterile
Petri Dish	Fisher	08-757- 100D	Sterile
Sterile drape	Sai Infusion Technology	PSS-SD1	Sterile
Surgery scissors	Roboz Surgical Store	RS-5960	Sterile
Tissue Forceps (claw forceps)	Roboz Surgical Store	RS-5158	Sterile
Wound clip applier	BD Autoclip Wound System	01-804	Sterile
Wound clip remover	BD Autoclip Wound System	01-804-15	Sterile
Wound clips	BD Autoclip Wound System	01-804-5	Sterile