Orthotope Transplantation von Brusttumoren als präklinische Modelle für Brustkrebs
Summary
Patientenbasierte Xenograft-Modelle (PDX) und transplantierbare gentechnisch veränderte Mausmodelle rekapitulieren menschliche Krankheiten originalgetreu und sind bevorzugte Modelle für die grundlegende und translationale Brustkrebsforschung. Hier wird eine Methode beschrieben, Brusttumorfragmente orthotopisch in das Brustfettpolster zu transplantieren, um die Tumorbiologie zu untersuchen und die Arzneimittelreaktion zu bewerten.
Abstract
Präklinische Modelle, die Tumorheterogenität und therapeutisches Ansprechen originalgetreu rekapitulieren, sind für die translationale Brustkrebsforschung von entscheidender Bedeutung. Immortalisierte Zelllinien sind leicht zu züchten und genetisch zu modifizieren, um molekulare Mechanismen zu untersuchen, aber der selektive Druck der Zellkultur führt im Laufe der Zeit oft zu genetischen und epigenetischen Veränderungen. Patientenbasierte Xenograft-Modelle (PDX) rekapitulieren die Heterogenität und Arzneimittelreaktion menschlicher Brusttumoren originalgetreu. PDX-Modelle weisen eine relativ kurze Latenz nach orthotopischer Transplantation auf, die die Untersuchung der Brusttumorbiologie und des Arzneimittelverhaltens erleichtert. Die transplantierbaren gentechnisch veränderten Mausmodelle ermöglichen die Untersuchung der Immunität von Brusttumoren. Das aktuelle Protokoll beschreibt die Methode, Brusttumorfragmente orthotopisch in das Brustfettpolster zu transplantieren, gefolgt von medikamentösen Behandlungen. Diese präklinischen Modelle bieten wertvolle Ansätze zur Untersuchung der Brusttumorbiologie, der Arzneimittelreaktion, der Biomarkerentdeckung und der Mechanismen der Arzneimittelresistenz.
Introduction
Die meisten Brustkrebstodesfälle können auf wiederkehrende Erkrankungen zurückgeführt werden, die gegen konventionelle Therapien resistent sind1,2. Die Inter- und Intratumorheterogenität von Brustkrebserkrankungen trägt zur Therapieresistenz bei. Darüber hinaus kann tumorheterogenität die genaue Prognose beeinträchtigt und das Krankheitsmanagement herausfordern3,4. Die Identifizierung prädiktiver Biomarker für das Ansprechen wird die klinischen Ergebnisse von Patientinnen mit Brustkrebs signifikant verbessern. Obwohl die meisten Brustkrebsarten immunologisch “kalte” Tumoren sind, die wahrscheinlich nicht auf eine Immuntherapie ansprechen, haben sich Immun-Checkpoint-Inhibitoren in klinischen Studienals vielversprechend erwiesen 2,5. Zum Beispiel zeigte eine Phase-III-Studie ein verbessertes krankheitsfreies Überleben (DFS) und vorläufige Beweise, dass Atezolizumab (monoklonaler Antikörper gegen PD-L1) in Kombination mit nab-Paclitaxel einen Gesamtüberlebensvorteil im Vergleich zu nab-Paclitaxel allein bei Tumoren mit ≥1% PD-L1-Färbung bieten kann6. Die Entwicklung von Therapien, die Brusttumoren für eine Immuntherapie sensibilisieren, wird die Behandlungsschemata revolutionieren.
Präklinische Modelle, die die Heterogenität und das Ansprechen von Brustkrebs beim Menschen originalgetreu rekapitulieren, sind entscheidend für die Untersuchung der Tumorbiologie und die Identifizierung potenzieller Biomarker für eine gezielte Therapie. Immortalisierte Zelllinien werden häufig für die Brustkrebsforschung verwendet, da diese Zelllinien leicht zu züchten und genetisch verändert sind, um molekulare Mechanismen zu untersuchen. Aufgrund des selektiven Drucks durch langfristige Zellkultur in vitro kann es jedoch im Laufe der Zeit zu genetischer Drift kommen und Brustkrebszelllinien können zelllinienspezifische genomische Veränderungen tragen, die sich von Aberrationen in primären Brusttumoren unterscheiden7,8,9.
Patienten-abgeleitete Xenograft (PDX) Tumorblöcke sind in der Lage, die Heterogenität der menschlichen Krankheit zu rekapitulieren, und sind histologisch und immunhistochemisch dem Tumor des Ursprungs10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29. Wichtig ist, dass PDX-Modelle phänotypisch stabil über mehrere Transplantationen hinweg sind, wie histologische, transkriptom-, Proteom- und genomische Analysenbelegen 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29. PDX-Modelle zeigen Behandlungsreaktionen, die mit denen vergleichbarsind,die klinisch beobachtet wurden10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24, 25,26,27,28,29. PDX-Modelle für Östrogenrezeptor-positive (ER+),Progesteronrezeptor-positive (PR+),epidermale Wachstumsfaktor-2-positive (ERBB2+,HER2+)und dreifach negative Brustkrebs (TNBC) PDX-Modelle wurden etabliert und bieten eine hervorragende Plattform, um endokrine, chemo- und zielgerichtete Therapien zu testen. Ein Hauptvorbehalt der PDX-Modelle ist derzeit jedoch das Fehlen eines funktionierenden Immunsystems in der Maus.
Die gentechnisch veränderten Mausmodelle (GEMM), wie Trp53 homozygote Null-, cMyc-, Wnt1-, PyMT- oder Her2-Überexpressionsmodelle, erlauben die Untersuchung spontaner Tumorinitiation, -progression und -metastasierung im Kontext eines intakten Immunsystems. Die Tumorlatenz ist jedoch lang, was es schwierig macht, präklinische Studien mit mehreren Armendurchzuführen 30,31. GEMM kann jedoch auf syngene Wirte transplantiert werden, um eine ausreichende Anzahl von Tumoren zu erzeugen, die die menschlichen Tumoren32,33,34 ,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45, 46,47,48,49,50,51,52,53,54,55. Zum Beispiel wurde das Brustepithel einer p53-Null-BALB / c-Maus in die gereinigten Fettpolster syngener Wildtyp-Empfängermäuse transplantiert, um Primärtumoren zu bilden, die weiter in syngene Wirte transplantiert werden können56,57. Die p53-Null-Tumoren rekapitulierten verschiedene Subtypen menschlicher Tumoren.
Die Kombination von PDX-Modellen und transplantierbarem GEMM bietet wertvolle präklinische Werkzeuge zur Untersuchung der Brusttumorbiologie, der Arzneimittelreaktion und der Antitumorimmunität. Im aktuellen Protokoll wird eine Methode der orthotopen Transplantation von PDX- und GEMM-Tumorfragmenten in das Brustfettpolster der Maus beschrieben. Diese Modelle sind für serielle Passagen geeignet und behalten in der Regel einen stabilen Phänotyp. Um das Risiko einer genetischen Drift oder eines Verlustes der Heterogenität über Passagen im Laufe der Zeit zu verringern, werden an jeder Passage mehrere Gewebefragmente für die anschließende Transplantation kryokonserviert, falls im Laufe der Zeit biologische oder morphologische Veränderungen beobachtet werden29,58.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um Variationen im Tumorwachstum bei Tieren zu reduzieren, ist es wichtig, das Tumorgewebe für die Transplantation in 1 mm3 Fragmente zu schneiden. Modelle, bei denen Weichgewebe wachsen, sind schwieriger zu bearbeiten und die Tumorfragmente müssen etwas größer geschnitten werden (1−2 mm3). Wenn Sie das Gewebe in die Brustfettpolstertasche legen, achten Sie darauf, das Gewebe nicht in mehrere Stücke zu spalten, da dies zu mehreren kleinen Tumoren oder seltsam geformten Tumoren führt.
<p c…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt von den National Institutes of Health (R37CA228304 und R01HL146642 bis Xi Chen, CA148761 an Jeffrey M. Rosen), dem US Department of Defense (W81XWH-19-1-0524 an Xi Chen, W81XWH-19-1-0035 an Xiangdong Lv), der American Cancer Society (RSG-18-181-01-TBE an Xi Chen) und dem Cancer Prevention and Research Institute of Texas (RR150009 CPRIT Scholar in Cancer Research Award an Xi Chen), der Patient-Derived Xenograft and Advanced In Vivo Models Core am Baylor College of Medicine (Finanzierung durch RP170691 CPRIT Core Facility Award und NCI-CA125123 P30 Cancer Center Support Grant).
Materials
| 1 mg/mL Buprenorphine-SR | ZooPharm (via BCM veterinarians) | Sterile | |
| 26G syringe | BD | 148232E | Sterile |
| Betadine Scrub | Fisher | 19-027132 | |
| Cotton Swabs | VWR International Laboratory | 89031-272 | Sterile |
| DMEM | Fisher | MT 10-013-CM | Sterile |
| Electric shaver | Oster | 78005-050 | |
| Glass beads sterilizer (Germinator) | Roboz Surgical Store | DS-401 | |
| Lubricant ophthalmic ointment | Akorn Animal Health | 17478-062-35 | |
| Micro Dissecting Forceps; Serrated, Angular (regular forceps) | Roboz Surgical Store | RS-5139 | Sterile |
| Micro Dissecting Spring Scissors (fat pad cutter) | Roboz Surgical Store | RS-5658BT | Sterile |
| Micro Forceps (tissue placing forceps) | Roboz Surgical Store | RS-5069 | Sterile |
| Petri Dish | Fisher | 08-757- 100D | Sterile |
| Sterile drape | Sai Infusion Technology | PSS-SD1 | Sterile |
| Surgery scissors | Roboz Surgical Store | RS-5960 | Sterile |
| Tissue Forceps (claw forceps) | Roboz Surgical Store | RS-5158 | Sterile |
| Wound clip applier | BD Autoclip Wound System | 01-804 | Sterile |
| Wound clip remover | BD Autoclip Wound System | 01-804-15 | Sterile |
| Wound clips | BD Autoclip Wound System | 01-804-5 | Sterile |
References
- Waks, A. G., Winer, E. P. Breast Cancer Treatment: A Review. JAMA. 321 (3), 288-300 (2019).
- Harbeck, N., et al. Breast cancer. Nature Reviews Disease Primers. 5 (1), 66 (2019).
- Harbeck, N., Salem, M., Nitz, U., Gluz, O., Liedtke, C. Personalized treatment of early-stage breast cancer: present concepts and future directions. Cancer Treatment Reviews. 36 (8), 584-594 (2010).
- Zardavas, D., Irrthum, A., Swanton, C., Piccart, M. Clinical management of breast cancer heterogeneity. Nature Reviews Clinical Oncology. 12 (7), 381 (2015).
- Esteva, F. J., Hubbard-Lucey, V. M., Tang, J., Pusztai, L. Immunotherapy and targeted therapy combinations in metastatic breast cancer. The Lancet Oncology. 20 (3), e175-e186 (2019).
- Schmid, P., et al. Atezolizumab and nab-paclitaxel in advanced triple-negative breast cancer. New England Journal of Medicine. 379 (22), 2108-2121 (2018).
- Tsuji, K., et al. Breast cancer cell lines carry cell line-specific genomic alterations that are distinct from aberrations in breast cancer tissues: comparison of the CGH profiles between cancer cell lines and primary cancer tissues. BMC Cancer. 10 (1), 15 (2010).
- Neve, R. M., et al. A collection of breast cancer cell lines for the study of functionally distinct cancer subtypes. Cancer Cell. 10 (6), 515-527 (2006).
- Clarke, R. Human breast cancer cell line xenografts as models of breast cancer-the immunobiologies of recipient mice and the characteristics of several tumorigenic cell lines. Breast Cancer Research and Treatment. 39 (1), 69-86 (1996).
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17 (11), 1514 (2011).
- Kuperwasser, C., et al. Reconstruction of functionally normal and malignant human breast tissues in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America of the United States of America. 101 (14), 4966-4971 (2004).
- Vaillant, F., et al. Targeting BCL-2 with the BH3 mimetic ABT-199 in estrogen receptor-positive breast cancer. Cancer Cell. 24 (1), 120-129 (2013).
- Li, S., et al. Endocrine-therapy-resistant ESR1 variants revealed by genomic characterization of breast-cancer-derived xenografts. Cell Reports. 4 (6), 1116-1130 (2013).
- DeRose, Y. S., et al. Patient-derived models of human breast cancer: protocols for in vitro and in vivo applications in tumor biology and translational medicine. Current Protocols in Pharmacology. 60 (1), 14.23.11-14.23.43 (2013).
- Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
- Marangoni, E., et al. A new model of patient tumor-derived breast cancer xenografts for preclinical assays. Clinical Cancer Research. 13 (13), 3989-3998 (2007).
- Zhang, H., et al. Patient-derived xenografts of triple-negative breast cancer reproduce molecular features of patient tumors and respond to mTOR inhibition. Breast Cancer Research. 16 (2), R36 (2014).
- Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature Reviews Immunology. 7 (2), 118 (2007).
- Sheffield, L. G., Welsch, C. W. Transplantation of human breast epithelia to mammary-gland-free fat-pads of athymic nude mice: Influence of mammotrophic hormones on growth of breast epithelia. International Journal of Cancer. 41 (5), 713-719 (1988).
- Sebesteny, A., et al. Primary human breast carcinomas transplantable in the nude mouse. Journal of the National Cancer Institute. 63 (6), 1331-1337 (1979).
- Sakakibara, T., et al. Growth and metastasis of surgical specimens of human breast carcinomas in SCID mice. The Cancer Journal from Scientific American. 2 (5), 291-300 (1996).
- Rae-Venter, B., Reid, L. M. Growth of human breast carcinomas in nude mice and subsequent establishment in tissue culture. Cancer Research. 40 (1), 95-100 (1980).
- Outzen, H., Custer, R. Brief communication: Growth of human normal and neoplastic mammary tissues in the cleared mammary fat pad of the nude mouse. Journal of the National Cancer Institute. 55 (6), 1461-1466 (1975).
- Noël, A., et al. Heterotransplantation of primary and established human tumour cells in nude mice. Anticancer Research. 15 (1), 1-7 (1995).
- Naundorf, H., Fichtner, I., Büttner, B., Frege, J. Establishment and characterization of a new human oestradiol-and progesterone-receptor-positive mammary carcinoma serially transplantable in nude mice. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 119 (1), 35-40 (1992).
- Murthy, M. S., Scanlon, E. F., Jelachich, M. L., Klipstein, S., Goldschmidt, R. A. Growth and metastasis of human breast cancers in athymic nude mice. Clinical and Experimental Metastasis. 13 (1), 3-15 (1995).
- Fichtner, I., Becker, M., Zeisig, R., Sommer, A. In vivo models for endocrine-dependent breast carcinomas: special considerations of clinical relevance. European Journal of Cancer. 40 (6), 845-851 (2004).
- Ding, L., et al. Genome remodelling in a basal-like breast cancer metastasis and xenograft. Nature. 464 (7291), 999 (2010).
- Zhang, X., et al. A renewable tissue resource of phenotypically stable, biologically and ethnically diverse, patient-derived human breast cancer xenograft models. Cancer Research. 73 (15), 4885-4897 (2013).
- Borowsky, A. D. Choosing a mouse model: experimental biology in context-the utility and limitations of mouse models of breast cancer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (9), a009670 (2011).
- Caligiuri, I., Rizzolio, F., Boffo, S., Giordano, A., Toffoli, G. Critical choices for modeling breast cancer in transgenic mouse models. Journal of Cellular Physiology. 227 (8), 2988-2991 (2012).
- Backlund, M. G., et al. Impact of ionizing radiation and genetic background on mammary tumorigenesis in p53-deficient mice. Cancer Research. 61 (17), 6577-6582 (2001).
- Jerry, D., et al. A mammary-specific model demonstrates the role of the p53 tumor suppressor gene in tumor development. Oncogene. 19 (8), 1052-1058 (2000).
- Hüsler, M. R., et al. Lactation-induced WAP-SV40 Tag transgene expression in C57BL/6J mice leads to mammary carcinoma. Transgenic Research. 7 (4), 253-263 (1998).
- Simin, K., et al. pRb inactivation in mammary cells reveals common mechanisms for tumor initiation and progression in divergent epithelia. PLoS Biology. 2 (2), e22 (2004).
- Sandgren, E. P., et al. Inhibition of mammary gland involution is associated with transforming growth factor α but not c-myc-induced tumorigenesis in transgenic mice. Cancer Research. 55 (17), 3915-3927 (1995).
- Gallahan, D., et al. Expression of a truncated Int3 gene in developing secretory mammary epithelium specifically retards lobular differentiation resulting in tumorigenesis. Cancer Research. 56 (8), 1775-1785 (1996).
- Tsukamoto, A. S., Grosschedl, R., Guzman, R. C., Parslow, T., Varmus, H. E. Expression of the int-1 gene in transgenic mice is associated with mammary gland hyperplasia and adenocarcinomas in male and female mice. Cell. 55 (4), 619-625 (1988).
- Guy, C. T., Cardiff, R., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).
- Guy, C. T., et al. Expression of the neu protooncogene in the mammary epithelium of transgenic mice induces metastatic disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (22), 10578-10582 (1992).
- Xu, X., et al. Conditional mutation of Brca1 in mammary epithelial cells results in blunted ductal morphogenesis and tumour formation. Nature Genetics. 22 (1), 37 (1999).
- Maroulakou, I. G., Anver, M., Garrett, L., Green, J. E. Prostate and mammary adenocarcinoma in transgenic mice carrying a rat C3 (1) simian virus 40 large tumor antigen fusion gene. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (23), 11236-11240 (1994).
- Yin, Y., et al. Characterization of medroxyprogesterone and DMBA-induced multilineage mammary tumors by gene expression profiling. Molecular Carcinogenesis. 44 (1), 42-50 (2005).
- Cressman, V. L., et al. Mammary tumor formation in p53-and BRCA1-deficient mice. Cell Growth and Differentiation-Publication American Association for Cancer Research. 10 (1), 1-10 (1999).
- Li, Z., et al. ETV6-NTRK3 fusion oncogene initiates breast cancer from committed mammary progenitors via activation of AP1 complex. Cancer Cell. 12 (6), 542-558 (2007).
- Pond, A. C., et al. Fibroblast growth factor receptor signaling dramatically accelerates tumorigenesis and enhances oncoprotein translation in the mouse mammary tumor virus-Wnt-1 mouse model of breast cancer. Cancer Research. 70 (12), 4868-4879 (2010).
- Sinn, E., et al. Coexpression of MMTV/v-Ha-ras and MMTV/c-myc genes in transgenic mice: synergistic action of oncogenes in vivo. Cell. 49 (4), 465-475 (1987).
- Muller, W. J., et al. The int-2 gene product acts as an epithelial growth factor in transgenic mice. The EMBO Journal. 9 (3), 907-913 (1990).
- Liu, S., et al. Expression of autotaxin and lysophosphatidic acid receptors increases mammary tumorigenesis, invasion, and metastases. Cancer Cell. 15 (6), 539-550 (2009).
- Torres-Arzayus, M. I., et al. High tumor incidence and activation of the PI3K/AKT pathway in transgenic mice define AIB1 as an oncogene. Cancer Cell. 6 (3), 263-274 (2004).
- Chan, S. R., et al. STAT1-deficient mice spontaneously develop estrogen receptor α-positive luminal mammary carcinomas. Breast Cancer Research. 14 (1), R16 (2012).
- Jiang, Z., et al. Rb deletion in mouse mammary progenitors induces luminal-B or basal-like/EMT tumor subtypes depending on p53 status. The Journal of Clinical Investigation. 120 (9), 3296-3309 (2010).
- Adams, J. R., et al. Cooperation between Pik3ca and p53 mutations in mouse mammary tumor formation. Cancer Research. 71 (7), 2706-2717 (2011).
- Pei, X. H., et al. CDK inhibitor p18INK4c is a downstream target of GATA3 and restrains mammary luminal progenitor cell proliferation and tumorigenesis. Cancer Cell. 15 (5), 389-401 (2009).
- Bultman, S., et al. Characterization of mammary tumors from Brg1 heterozygous mice. Oncogene. 27 (4), 460 (2008).
- Jerry, D., et al. A mammary-specific model demonstrates the role of the p53 tumor suppressor gene in tumor development. Oncogene. 19 (8), 1052 (2000).
- Zhang, M., et al. Identification of tumor-initiating cells in a p53-null mouse model of breast cancer. Cancer Research. 68 (12), 4674-4682 (2008).
- Landis, M. D., Lehmann, B. D., Pietenpol, J. A., Chang, J. C. Patient-derived breast tumor xenografts facilitating personalized cancer therapy. Breast Cancer Research. 15 (1), 201 (2013).
- Zhang, X., Lewis, M. T. Establishment of Patient-Derived Xenograft (PDX) Models of Human Breast Cancer. Current Protocols in Mouse Biology. 3 (1), 21-29 (2013).
- Chi, V., Chandy, K. G. Immunohistochemistry: paraffin sections using the Vectastain ABC kit from vector labs. Journal of Visualized Experiments. (8), e308 (2007).
- Zhao, N., et al. Pharmacological targeting of MYC-regulated IRE1/XBP1 pathway suppresses MYC-driven breast cancer. Journal of Clinical Investigation. 128 (4), 1283-1299 (2018).
- DeOme, K., Faulkin, L., Bern, H. A., Blair, P. B. Development of mammary tumors from hyperplastic alveolar nodules transplanted into gland-free mammary fat pads of female C3H mice. Cancer Research. 19 (5), 515 (1959).
