Мы представляем модель сосудистых заболеваний in vitro для исследования взаимодействия всей крови с эндотелием, полученным пациентом. Эта система позволяет изучать тромбогенные свойства первичных эндотелиальных клеток при различных обстоятельствах. Метод особенно подходит для оценки тромбогенности и антикоагуляционной терапии на различных стадиях коагуляции.
Формирование тромбов включает в себя сложные взаимодействия между эндотелиальными клетками, их основной матрицей, различными клетками крови и белками. Эндотелий является основным источником многих основных гемостатических молекул, которые контролируют агрегацию тромбоцитов, коагуляцию и фибринолиз. Хотя механизм тромбоза был исследован в течение десятилетий, в пробирке исследования в основном сосредоточены на ситуациях повреждения сосудов, где субендотелиальной матрицы подвергается воздействию, или на взаимодействия между клетками с одиночными компонентами крови. Наш метод позволяет изучать взаимодействия между целой кровью и нетронутой, сливаемой сосудистой клеточной сетью.
Используя первичные эндотелиальные клетки человека, этот протокол предоставляет уникальную возможность изучить влияние эндотелиальных клеток на динамику тромбов и дает ценную информацию о патофизиологии тромботических заболеваний. Использование заказных каналов микрофлюидного потока позволяет использовать специфические для заболеваний сосудистые геометрии и моделировать специфические морфологические сосудистые изменения. Развитие тромба регистрируется в режиме реального времени и количественно характеризуется адгезией тромбоцитов и осаждением фибрина. Влияние эндотелиальной функции в измененной динамике тромба определяется потанализом через иммунофлуоресценцию окрашивания конкретных молекул.
Репрезентативные результаты описывают экспериментальную установку, сбор данных и анализ данных. В зависимости от исследовательского вопроса, параметры для каждого раздела могут быть скорректированы, включая тип клетки, скорость снора, геометрию канала, медикаментозную терапию и процедуры постанализа. Протокол подтверждается количественной оценкой образования тромба на эндотелии легочной артерии пациентов с хроническим тромбоэмболическим заболеванием.
Эндотелий образует внутренний клеточный слой кровеносных сосудов и отделяет кровь от окружающих тканей. Он был описан как динамический орган, который активно регулирует свою микро-среду и реагирует на внешние раздражители1. Из-за прямого контакта с проточной кровью, эндотелий имеет решающее значение в борьбе с гемостазом и тромбозом и является основным источником многих основных регуляторных молекул, которые контролируют агрегацию тромбоцитов, коагуляцию и фибринолиз2. Здоровые, неактивированные эндотелиальные клетки (EC) производят несколько молекул, которые противодействуют активации тромбоцитов и предотвращают образование коагуляции и тромбов для поддержания кровотока, таких как простациклин, тромбомодулин или ингибитор фактора ткани (TFPI)2,3. Это предотвращает адгезию тромбоцитов, агрегацию тромбоцитов и образование тромбоцитов. Травма или активация стенки сосуда приводит к прокоагулянт эндотелиального фенотипа, который инициирует локализованную адгезию тромбоцитови образование сгустка 2,,4. При эндотелиальной активации тромбоциты придерживаются фактора фон Виллебранда (VWF), мультимерного белка, высвобождаемого из ЭК, или подвергаются воздействию связывающих участков лежащей в основе субендотелиальной матрицы. Впоследствии молекулярные изменения тромбоцитов и воздействие фактора ткани (TF) инициируют активацию системы коагуляции, которая вызывает образование тромбов путемполимеризации фибрина 5,,6. Вместе полученный сгусток обеспечивает основу для замыкания ран путем повторной эндотелиализации7. Возмущения системы коагуляции могут привести к нарушениям кровотечения, таким как болезнь фон Виллебранда, гемофилия или тромбоз, которые часто являются результатом дисрегулируемого про- и антитромботического баланса эндотелиального гемостаногопути 2,3.
Процесс гемостаз происходит как в артериальной, так и венозной циркуляции. Однако механизмы, лежащие в основе артериального и венозного тромбоза, принципиально отличаются. В то время как артериальный тромбоз, как видно из ишемической болезни сердца, в основном обусловлен разрывом атеросклеротической бляшки в условиях высокого стресса стрижки, венозный тромбоз в основном развивается при отсутствии эндотелиальной травмы всостоянии застоя 8,9,10. Тромб глубоких вен может эмболизироваться и путешествовать к легочным артериям, где он вызывает легочную эмболию. Это может привести к хроническим сосудистым обструкциям, что приведет к значительному нарушению функциональных возможностей, которые могут способствовать развитию хронических заболеваний легких, включая развитие хронической тромбоэмболической легочной гипертензии (КТЭФ)11,,12,,13,,14. CTEPH характеризуется повышенным давлением легких из-за препятствий легочных артерий тромбоэмболическим материалом после по крайней мере трех месяцев антикоагуляционнойтерапии 15. В дополнение к эмболии легких, постулируется, что легочный эндотелий обеспечивает протромботической среде в CTEPH, что облегчает тромбоз на месте и хронические препятствия легочных артерий, вызывая увеличение артериального давления, что в конечном итоге может привести к сердечной недостаточности,если не лечить 16,17.
За последние годы, различные исследования привели к развитию анализов для изучения формирования тромбоцитов путем измерения функции тромбоцитов и свертывания18. Тем не менее, большинство из них либо изучить взаимодействие всей крови с одним внеклеточных компонентов матрицы, как коллагены или фибрины, или эндотелиальной функции во взаимодействии с одиночными компонентами крови, таких как эндотелиально-тромбоцитов или эндотелиально-лейкоцитоввзаимодействия 19,20,21,22. Эти анализы чаще всего выполняются с пуповинной вены эндотелиальных клеток (HUVEC), так как эти клетки легко получить. Тем не менее, гемостатические гены дифференциально выражены через сосудистое дерево,типы сосудови систем органов 23,24, что делает использование HUVECs представлять эндотелиальные клетки, участвующие в артериальном тромбозе или легочной эмболиипроблематично 23.
В дополнение к пластичность ЕС, болезнеспецифические гемодинамические изменения и изменения в сосудистой морфологии могут способствовать образованию тромба при нормальномэндотелии 25. Более высокие показатели стрижки, из-за местной сосудосуживающих или изменения геометрии сосудов, например, может привести к острой тромбообразования, вызывая стеноз, который ускоряет прекращениекровотока 26. Использование специально изготовленных каналов микроинженерных потоков позволяет специально проектировать сосудистые геометрии, которые являются репрезентативными для (пато)биологии. Таким образом, можно изучить влияние местных биомеханических сил на здоровую или больной ЭК27.
Существуют антикоагуляционные методы лечения, доступные для ориентации различных фаз и молекул в каскаде коагуляции, которые представляют особые риски и преимущества, которые могут быть специфичны для определенных расстройств. Подход к моделированию заболеваний, описанный в настоящем документе, особенно подходит для проверки влияния различных антикоагуляционных и антитромбоцитатурных методов лечения на динамику тромбов.
Цель состоит в том, чтобы представить модель тромбоза, которая включает в себя первичные ЭК, что дает универсальную модель, подходящую для анализа различных форм тромбоза в зависимости от типа используемых первичных ЭК. В качестве иллюстрации мы использовали эндотелиальные клетки легочной артерии пациентов CTEPH во взаимодействии с всей человеческой кровью, содержащей все компоненты, участвующие в формировании тромбоцитов (тромбоциты, лейкоциты, эритроциты, свертываемые белки и кофакторы). Этот подход может применяться в коммерческих параллельных каналах потока или в специально изготовленных каналах микрофлюидных потоков с определенной сосудистой конструкцией. Таким образом, модель может в конечном итоге быть использована в изучении формирования тромба и разрешения, для оценки воспалительных реакций в моделировании заболеваний, для антитромбоцита или антикоагуляционной терапии, и в конечном счете для персонализированной медицины.
Это исследование описывает изоляцию первичных эндотелиальных клеток легочной артерии человека. Для изоляции других первичных типов эндотелиальных клеток человека, мы ссылаемся на ранее опубликованные методы, в том числе легочных микрососудистыхэндотелиальных клеток 25, человека пупочной веныэндотелиальных клеток 28, и кровь циркулирующих эндотелиальной колонии формирования клеток Рисунок 1A29.
Коагуляция является результатом сложного и временно контролируемого взаимодействия между эндотелием и компонентами крови. Этот анализ in vitro представляет собой метод исследования тромбогенных свойств эндотелиальных клеток в режиме реального времени. Различные типы первичных эндотелиальных клеток человека могут быть использованы, облегчая тромбоз на месте в органе и пациента конкретных образом. В этом исследовании мы проиллюстрировали использование этого протокола, сравнивая тромбогенные свойства ПАУЦ, изолированных от здоровых доноров, по сравнению с пациентами CTEPH. Формирование живого тромба изучалось путем перфузии цельной крови здоровых испытуемых над эндотелием, активированным гистамином, в то время как эффект DOAC был протестирован как антитромботический агент.
Помимо использования коммерчески доступных микроканалов, как показано в репрезентативных результатах, внедрение заказных микрофлюидных каналов позволяет изучить влияние изменений сосудистой геометрии на образование тромбов. Например, уменьшение потока в точке ветви или стеноз приводит к увеличению стресса стрижки и больше активации тромбоцитов36. Тем не менее, значительное ограничение этих заказных микрофлюидных каналов является требование высоких номеров клеток, чтобы сформировать стабильный монослой ECs, как описано в шаге 2.3.2. Это может представлять граничающее фактор, когда клетки, полученные пациентом, являются дефицитными. Сильные стороны коммерчески доступных микросхем в том, что поверхностные области модифицируются для клеточной культуры, а области роста больше, что позволяет ЭК образовывать сотый и стабильный монослой. С другой стороны, большая площадь поверхности приведет к большему люмену. Согласно Equation 1, это требует более высоких объемов крови, чтобы достичь аналогичных скоростей потока, как в заказной микрофлюиды.
Улучшение этого протокола может быть для расследования живых потерь ЕС или изменения в целостности барьера. Ущерб ЕС в этом протоколе измеряется только в конце эксперимента. Для отслеживания в реальном времени, ECs могут быть помечены с mCherry VE-кадерин, например37. Однако, поскольку это потребуется очень оптимизированный протокол с эффективной трансфекции вируса, Электрические клетки-субстрат Impedance зондирования (ECIS) могут быть использованы в качестве альтернативы для изучения эндотелиальной целостности и барьерной функции38. Перфузия по специальным каналам потока ECIS позволяет продольный мониторинг эндотелиальной барьерной целостности под потоком. Эти специфические функции ECIS позволяют проводить параллельные измерения эндотелиальных барьерных свойств и образования тромбов. Альтернативные способы параллельных измерений барьера ЕС, особенно в специально изготовленных массивах, включают использование флуоресцентного дектранса в перфусате, который рассеивается из люмена, в зависимости от барьерных свойств ЕС.
Ограничение описанного протокола заключается в том, что ЭК удаляются из организма человека и культуриются на пластике культуры тканей, который является жестким искусственным субстратом. Клетки адаптируются к своей биофизической среде. Это может повлиять на эндотелианую реакцию на активацию тромбоцитов, так как существует связь между активацией тромбоцитов и жесткостьюстенок 39. Несмотря на эти адаптации к культуре пластмассы, клетки держать болезни конкретных характеристик, которые могут быть определены в прямом сравнении с ЭК, полученных от здоровых доноров, как показано с контролем, CTEPH-PAEC, и HUVEC, которые оказывают различные модели ссадины тромбоцитов и фибрина осаждения после 5 мин перфузии крови.
В отличие от других протоколов, эта система использует всю кровь, в то время как другие изучают взаимодействие ЕС с одним компонентом крови, таким как тромбоцитыи лейкоциты 19,20,21. Разработаны более продвинутые микрофлюидные модели, позволяющие изучать эндотелиальную функцию в сосудистой модели с геометрией круглого сосуда и мягкой внеклеточной матрицей. Тем не менее, они оптимизированы с HUVECs40,41,42. Новизна описанного протокола заключается в использовании первичных эквалайзеров в сочетании с целой кровью, что приближает моделирование тромбоза на месте на один шаг к условиям in vivo. Оптимизировал протокол для использования полученных пациентом ЭК и крови пациентов дополнительно оптимизирует моделирование заболеваний в пробирке,что позволяет оценить персонализированное образование тромбов и медикаментозное лечение.
Описанный протокол может быть применен для изучения влияния антикоагуляционной терапии на клетки, полученные пациентом. В то время как мы использовали дабигатран для ингибирования образования тромбов, можно использовать другие антикоагулянты, такие как ривароксабан, который непосредственно подавляет фактор Xa в каскаде коагуляции. Ингибиторы прямой тромбоцитов, такие как клопидогрель или аспирин, также могут быть изучены, так как они действуют на основной фазе гемостазы, где тромбоциты связываются с ЭК. В конечном счете, тромбогенные возможности конкретных эквалайзеров пациента во взаимодействии с собственной кровью пациента могут быть использованы для прогнозирования личного эффекта антикоагуляционной терапии на отдельного пациента. Кроме того, нокдаун конкретных белков может обеспечить дополнительную функциональную информацию.
Есть некоторые шаги в описаном протоколе, которые имеют решающее значение для успешного эксперимента перфузии. Во-первых, во время изоляции первичных клеток необходимо получить очень чистую культуру ЕС. Во-вторых, важно, чтобы ЭК образуют стабильный стеченный монослой. Если это не так, небольшое изменение в стрессе стрижки может привести к эндотелиальному повреждению и активации каскада коагуляции, или тромбоциты могут начать связываться с мембраной подвала, что даст ложноположительные результаты. В-третьих, важно предотвратить пузырьки воздуха, так как они могут повредить эндотелий и тем самым повлиять на результаты.
После перекалибровки цитированных крови хлоридом кальция и хлоридом магния важно немедленно начать эксперимент по перфузии. Перекалибвание вызывает быструю реакцию на активацию тромбоцитов и образование тромбов, что приводит к быстрой свертываемости в образце.
В заключение, мы описываем очень универсальный протокол для изучения целых кровенозно-эндотелиальных клеточных взаимодействий во время тромбоза.
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Яна Вурберга из Кафедры плазменных белков, Лаборатории исследований Санкина и Ландштайнера, Амстердам UMC, Академический медицинский центр, Амстердам, Нидерланды, за его вклад в эту рукопись. Эта работа была поддержана Голландским кардиососудистым альянсом (DCVA) (2012-08, 2014-11), присужденным консорциуму Phaedra и Reconnect, а также грантом Impulse 2018, предоставленным консорциуму Phaedra IMPACT. Эти гранты включают коллективное финансирование Голландского фонда сердца, Голландской федерации университетских медицинских центров, Нидерландской организации по исследованиям и разработкам в области здравоохранения и Королевской нидерландской академии наук. Кроме того, эта работа финансировалась Европейским исследовательским советом в рамках программы Advanced Grant ‘VESCEL’ (номер гранта: 669768). XDM финансируется за счет научно-исследовательского гранта Института кардиососудистых исследований (ICaR-VU) в Медицинском центре Университета VU, Амстердам, Нидерланды.
20 mL syringe | BD Plastipak | 300613 | |
20X objective | Olympus | ||
2-Propanol (IPA) | Boom | 76051455 . 5000 | |
Aladdin Syringe Pump | Word Precision Instruments | AL-4000 | |
Alexa488-Fibrinogen | Invitrogen | F13191 | 15 ug/mL |
Alexa647 Goat anti Rabbit | Invitrogen | A21245 | 0.180555556 |
Biopsy punch 1 mm diameter, Integra Miltex | Ted Pella | 15110-10 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A9647 | |
CaCl2 | Sigma Aldrich | 21115 | |
Calcein AM-Red | Invitrogen | C3099 | 1:1000 |
CD42b-APC | Miltenyi Biotec | 130-100-208 | 1:100 |
Citric Acid | Merck | 244 | |
Collagen Typ I | Corning | 354249 | 0,1 mg/mL |
Corning CellBIND Surface 60 mm Culture Dish | Corning | 3295 | |
Cross-flow hood | Basan | ||
Desiccator | Duran | 24 782 69 | |
D-Glucose | Merck | 14431-43-7 | |
EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
Endothelial Cell Medium (ECM) | ScienCell | 1001 | |
Fibronectin | Sigma Aldrich | F0895 | |
Flow tubings | ibidi | 10831, 10841 | |
Gelatin | Merck | 104070 | 0.1% |
HEPES | Sigma Aldrich | H4034 | |
Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | 1:1000 |
ibidi µ-Slide VI 0.4 flow chambers | ibidi | 80606 | |
ImageJ | ImageJ | v1.49 | |
KCl | Merck | 7447-40-7 | |
Lab oven | Quincy | 10GC | |
LS720 Fluorescent microscope | etaluma | LS720 | |
Luer connector | ibidi | 10802, 10825 | Male elbow connectors, and Female tube connectors |
MACS magnetic beads (anti-CD144) | Miltenyi Biotec | 130-097-857 | 1:5 |
MgCl2 | Sigma Aldrich | M1028 | |
Microscopy slides, 76 x 26 mm | Thermo Scientific | AAAA000001##12E | |
Negative photoresist, SU-8 | Microchem | ||
Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Lonza | 13-114E | |
Paraformaldehyde (PFA) | Merck | 818715 | 4% PFA in PBS |
Penicillin/streptomycin (P/S) | Gibco | 15140-122 | 1% |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-094 | |
Plasma chamber, CUTE | Femto Science | ||
Polydimethylsiloxane (PDMS), Sylgard 184 | Dow | 101697 | |
sodium citrate blood collection tubes | BD Vacutainer | 363048 | |
trisodium citrate | Merck | 6448 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300-045 | |
VE-Cadherin (D87F2)-XP | Cell Signaling | 2500 | 1:300 |