我们提出了一个体外血管疾病模型,以研究整个血液与患者衍生的内皮的相互作用。该系统允许研究各种情况下原发内皮细胞的血栓特性。该方法特别适用于凝血不同阶段的原位血栓形成性和抗凝治疗。
血块的形成涉及内皮细胞、其底层基质、各种血细胞和蛋白质之间的复杂相互作用。内皮是控制血小板聚集、凝固和纤维化的许多主要止血分子的主要来源。虽然血栓形成的机制已经研究了几十 年 ,体外研究主要侧重于血管损伤的情况,其中下皮基质暴露,或细胞与单血成分之间的相互作用。我们的方法允许研究全血和完整的,汇合血管细胞网络之间的相互作用。
通过利用原发性人类内皮细胞,该协议为研究内皮细胞对血栓动力学的影响提供了独特的机会,并为血栓疾病的病理生理学提供了宝贵的见解。使用定制的微流体流通道可以应用疾病特异性血管几何体和模型特定的形态血管变化。血栓的发育记录为实时和定量特征,以血小板粘附和纤维素沉积为特征。通过特定分子的免疫荧光染色,通过后分析确定内皮功能在改变的血栓动力学中的影响。
代表性的结果描述了实验设置、数据收集和数据分析。根据研究问题,每个部分的参数都可以调整,包括细胞类型、剪切速率、通道几何形状、药物治疗和后分析程序。通过量化慢性血栓栓塞病患者肺动脉内皮的血栓形成,验证了该方案。
内皮形成血管的内部细胞层,将血液与周围组织分离。它被描述为一个动态的器官,积极调节其微环境,并响应外部刺激1。由于其与流动血液的直接接触,内皮在控制血栓和血栓形成方面起着关键作用,并且是控制血小板聚集、凝固和纤维化2的许多主要调节分子的主要来源。健康、非活性内皮细胞(EC)产生多种分子,可抑制血小板活化,防止凝血和血栓形成,维持血液流动,如蛋白素、血栓素或组织因子通路抑制剂(TFPI)2、3。2,这可防止血小板的粘附、血小板聚集和血栓形成。血管壁的伤害或激活导致一个超凝内皮表型,启动局部血小板粘附和凝块形成2,2,4。当内皮激活血小板粘附于冯·威利布兰德因子(VWF)时,一种从ECs释放的多美蛋白,或与底层下表皮基质的暴露结合位点结合。随后,血小板的分子变化和接触组织因子(TF)启动凝固系统的激活,通过纤维蛋白聚合5,6,诱导血栓的形成。由此产生的血块共同通过重新内皮化7为伤口闭合提供了基础。凝固系统的扰动可能导致出血性疾病,如冯·威利布兰德病、血友病或血栓形成,这些疾病通常是由于内皮止血通路2、3,的调节失调和抗血性平衡引起的。
血液扩张过程发生在动脉和静脉循环中。然而,动脉和静脉血栓形成背后的机制是根本不同的。而动脉血栓形成,如缺血性心脏病,主要是由动脉硬化斑块在高剪切应力条件下破裂,静脉血栓主要在没有内皮损伤的情况下发展,在停滞8,9,10,9,10的情况下。深静脉血栓可能栓塞并前往肺动脉,导致肺栓塞。这可能导致慢性血管阻塞导致功能能力严重受损,可能促进胆肺疾病的发展,包括慢性血栓性肺高血压(CTEPH)11、12、13、14的发展。11,12,13,14CTEPH的特点是肺压升高,由于肺动脉阻塞的血栓物质后,至少三个月的抗凝治疗15。除了肺栓塞,假设肺内皮在CTEPH中提供了一个前血型环境,促进肺动脉的原位血栓形成和慢性阻塞in situ,导致血压升高,最终可能导致心力衰竭,如果不治疗16,17。,17
在过去的几年里,各种研究已经导致通过测量血小板功能和凝固18来检查血栓形成分析的发展。然而,他们中的大多数要么研究全血与胶原蛋白或纤维素等单细胞外基质成分的相互作用,要么研究内皮功能与单血分量的相互作用,如内皮-血小板或内皮-白细胞相互作用19、20、21、22。19,20,21,22这些测定最常见的是人体脐静脉内皮细胞(HUVEC),因为这些细胞很容易获得。然而,止血基因在血管树、血管类型和器官系统23、24,24之间以不同方式表达,利用HUVECs来表示动脉血栓形成或肺栓塞问题23的内皮细胞。
除了EC的可塑性,疾病特异性血液动力学的改变和血管形态的变化可以促进血栓形成在正常的内皮25。较高的剪切率,由于局部血管收缩或血管几何形状的变化,例如,可能会导致急性血栓的形成,导致狭窄,加速停止血液流动26。使用定制的微工程流通道可以专门设计代表(病态)生物学的血管几何形状。这样,研究局部生物力学力量对健康或患病EC27的影响是可能的。
有抗凝疗法可用于针对凝血级联的不同阶段和分子,所有这些都构成特定的风险和好处,可以特定于某些疾病。本文所述的疾病建模方法特别适用于测试各种抗凝和抗血小板疗法对血栓动力学的影响。
其目的是呈现一个包括原发性 IC 的血栓形成模型,生成一个多功能模型,根据使用的原发 CS 类型分析各种形式的血栓形成。作为一个例子,我们使用CTEPH患者的肺动脉内皮细胞与整个人体血液相互作用,其中包含血栓形成中涉及的所有成分(血小板、白细胞、红细胞、凝血蛋白和辅助因子)。这种方法可应用于商业并行流量通道或具有特定血管设计的定制微流体流通道中。因此,该模型最终可用于血栓形成和分辨率的研究,用于疾病建模中的炎症反应评估,用于抗血小板或抗凝治疗,并最终用于个性化药物。
本研究描述了原发性人类肺动脉内皮细胞的分离。对于其他原发性人类内皮细胞类型的分离,我们参考了以前发表的方法,包括肺微血管内皮细胞25、人类脐静脉内皮细胞28、血循环内皮组形成细胞图1A29。29
凝固是内皮和血液成分之间复杂和时间控制相互作用的结果。 这种体外 测定提出了一种实时研究内皮细胞血栓形成特性的方法。可以使用各种类型的原发性人类内皮细胞, 促进器官 和患者特定方式的原位血栓形成。在这项研究中,我们说明了本协议的使用,比较了从健康捐赠者分离的PAECs与CTEPH患者的血栓生成特性。活血栓的形成通过健康受试者对组胺激活内皮的全血灌注进行了研究,而 DOAC 的效果则被测试为抗血栓剂。
除了使用市售的微通道外,如代表性结果所示,定制微流体通道的引入使研究血管几何变化对血栓形成的影响。例如,在分支点处流量减少或狭窄会导致剪切应力增加和更多的血小板激活36。然而,这些定制的微流体通道的一个显著限制是要求高细胞数形成一个稳定的单层ECs,如步骤2.3.2所述。当患者衍生细胞稀缺时,这可能成为一个限制因素。市售微滑梯的优点是,为细胞培养和生长区域修改表面积,从而使电子资源形成一个汇合和稳定的单层。另一方面,更大的表面积将导致更大的流明。根据 公式1,这需要更高的血液量达到类似的流速,在定制的微流体。
此协议的改进可能是调查实时 EC 丢失或屏障完整性的变化。本协议中的EC损伤仅在实验结束时进行测量。对于实时跟踪,可以使用 mCherry VE 卡德林标记 2S,例如37。然而,由于这将需要一个高度优化的协议与有效的病毒转染,电细胞基板阻抗感电(ECIS)可以作为一种替代研究内皮完整性和阻隔功能38。通过特殊的 ECIS 流量通道进行灌注,可以纵向监控流中的内皮屏障完整性。这些特定的 ECIS 功能允许平行测量内皮屏障特性和血栓形成。并行 EC 阻隔测量的替代方法,特别是在定制阵列中,包括在香水中使用荧光德克斯特,根据 EC 阻隔特性,从流明中扩散出来。
所述协议的一个限制是,2C从人体中去除,并在组织培养塑料上培养,这是一种僵硬的人造基质。细胞适应其生物物理环境。这可能会影响血小板激活的内皮反应,因为血小板活化和壁面刚度39之间有关联。尽管这些适应培养塑料,细胞保持疾病特异性特征,可以直接比较从健康捐赠者派生的EC,如与控制,CTEPH-PAEC和HUVEC,产生不同的模式血小板粘附和纤维素沉积后,5分钟的血液灌注。
与其他协议相比,该系统使用全血,而其他系统则研究EC与单一血液成分(如血小板和,白细胞19、20、21)19,20的相互作用。已经开发出更先进的微流体模型,允许研究血管模型中的内皮功能与圆形容器几何和软细胞外基质。但是,这些是使用 HUVEC,40,、41、42 进行优化的。所述协议的新颖性是使用原发性 PC 与全血结合,使原位血栓形成模型更接近体内条件。优化了患者衍生的ECs和患者衍生血液的使用方案,进一步优化了体外疾病模型,从而可以评估个性化的血栓形成和药物治疗。
所述方案可用于研究抗凝疗法对患者衍生细胞的影响。虽然我们使用达比加特兰来抑制血栓的形成,但有可能使用其他抗凝剂,如利瓦罗沙班,它直接抑制凝血级联中的因子Xa。直接血小板抑制剂,如氯皮多格雷或阿司匹林,也可以研究,因为这些作用于血小板与ECs结合的血小板的初级阶段。最终,患者特异性ECs与患者自身血液相互作用的血栓生成能力可用于预测抗凝治疗对单个患者的个人影响。此外,分解特定蛋白质可以提供额外的功能信息。
描述的协议中有些步骤对于成功的灌注实验至关重要。首先,在原细胞分离过程中,需要获得高度纯正的EC培养。其次,2、2、2、2、2、2、2、2、2、2、2、2、2、2、2、2、2、2、如果不是这样,剪切应力的轻微变化可能会导致内皮损伤和凝固级联的激活,或血小板可以开始与地下室膜结合,这将提供误报结果。第三,防止气泡至关重要,因为气泡会损害内皮,从而影响结果。
用氯化钙和氯化镁重新计算血液后,立即开始灌注实验。重新计算诱导血小板活化和血栓形成快速反应,导致样品中快速凝固。
最后,我们描述了一个高度通用的协议,用于研究血栓形成期间整个血内皮细胞相互作用。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢来自荷兰阿姆斯特丹UMC、学术医学中心的血浆蛋白系、桑金研究和兰德施泰纳实验室的Jan Voorberg,他在这份手稿中的投入。这项工作得到了荷兰心血管联盟(DCVA)[2012-08,2014-11]奖授予费德拉和重新连接财团以及2018年动力赠款授予费德拉影响财团的支持。这些赠款包括荷兰心脏基金会、荷兰大学医学中心联合会、荷兰卫生研究与发展组织和荷兰皇家科学院的集体资助。此外,这项工作由欧洲研究理事会资助,由高级赠款”VESCEL”计划(赠款编号:669768)。XDM由荷兰阿姆斯特丹VU大学医学中心心血管研究所(ICaR-VU)的研究资助。
20 mL syringe | BD Plastipak | 300613 | |
20X objective | Olympus | ||
2-Propanol (IPA) | Boom | 76051455 . 5000 | |
Aladdin Syringe Pump | Word Precision Instruments | AL-4000 | |
Alexa488-Fibrinogen | Invitrogen | F13191 | 15 ug/mL |
Alexa647 Goat anti Rabbit | Invitrogen | A21245 | 0.180555556 |
Biopsy punch 1 mm diameter, Integra Miltex | Ted Pella | 15110-10 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A9647 | |
CaCl2 | Sigma Aldrich | 21115 | |
Calcein AM-Red | Invitrogen | C3099 | 1:1000 |
CD42b-APC | Miltenyi Biotec | 130-100-208 | 1:100 |
Citric Acid | Merck | 244 | |
Collagen Typ I | Corning | 354249 | 0,1 mg/mL |
Corning CellBIND Surface 60 mm Culture Dish | Corning | 3295 | |
Cross-flow hood | Basan | ||
Desiccator | Duran | 24 782 69 | |
D-Glucose | Merck | 14431-43-7 | |
EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
Endothelial Cell Medium (ECM) | ScienCell | 1001 | |
Fibronectin | Sigma Aldrich | F0895 | |
Flow tubings | ibidi | 10831, 10841 | |
Gelatin | Merck | 104070 | 0.1% |
HEPES | Sigma Aldrich | H4034 | |
Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | 1:1000 |
ibidi µ-Slide VI 0.4 flow chambers | ibidi | 80606 | |
ImageJ | ImageJ | v1.49 | |
KCl | Merck | 7447-40-7 | |
Lab oven | Quincy | 10GC | |
LS720 Fluorescent microscope | etaluma | LS720 | |
Luer connector | ibidi | 10802, 10825 | Male elbow connectors, and Female tube connectors |
MACS magnetic beads (anti-CD144) | Miltenyi Biotec | 130-097-857 | 1:5 |
MgCl2 | Sigma Aldrich | M1028 | |
Microscopy slides, 76 x 26 mm | Thermo Scientific | AAAA000001##12E | |
Negative photoresist, SU-8 | Microchem | ||
Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Lonza | 13-114E | |
Paraformaldehyde (PFA) | Merck | 818715 | 4% PFA in PBS |
Penicillin/streptomycin (P/S) | Gibco | 15140-122 | 1% |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-094 | |
Plasma chamber, CUTE | Femto Science | ||
Polydimethylsiloxane (PDMS), Sylgard 184 | Dow | 101697 | |
sodium citrate blood collection tubes | BD Vacutainer | 363048 | |
trisodium citrate | Merck | 6448 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300-045 | |
VE-Cadherin (D87F2)-XP | Cell Signaling | 2500 | 1:300 |