Wir präsentieren ein In-vitro-Modell für Gefäßerkrankungen, um Vollblut-Wechselwirkungen mit patientenabgeleitetem Endothel zu untersuchen. Dieses System ermöglicht die Untersuchung der thrombogenen Eigenschaften der primären Endothelzellen unter verschiedenen Umständen. Das Verfahren eignet sich besonders zur Beurteilung der Thrombogenität und Antikoagulationstherapie in verschiedenen Phasen der Gerinnung.
Die Bildung von Blutgerinnseln beinhaltet komplexe Wechselwirkungen zwischen Endothelzellen, ihrer zugrunde liegenden Matrix, verschiedenen Blutzellen und Proteinen. Das Endothel ist die primäre Quelle vieler der wichtigsten hämostatischen Moleküle, die Thrombozytenaggregation, Gerinnung und Fibrinolyse steuern. Obwohl der Mechanismus der Thrombose seit Jahrzehnten untersucht wird, konzentrieren sich In-vitro-Studien hauptsächlich auf Situationen von Gefäßschäden, in denen die subendotheliale Matrix exponiert wird, oder auf Wechselwirkungen zwischen Zellen mit einzelnen Blutbestandteilen. Unsere Methode ermöglicht die Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen Vollblut und einem intakten, konfluenten Vaskulärenzellnetzwerk.
Durch die Verwendung primärer menschlicher Endothelzellen bietet dieses Protokoll die einzigartige Möglichkeit, den Einfluss von Endothelzellen auf die Thrombusdynamik zu untersuchen und gibt wertvolle Einblicke in die Pathophysiologie thrombotischer Erkrankungen. Die Verwendung von kundenspezifischen mikrofluidischen Strömungskanälen ermöglicht die Anwendung krankheitsspezifischer Gefäßgeometrien und modellspezifische morphologische Gefäßveränderungen. Die Entwicklung eines Thrombus wird in Echtzeit und quantitativ durch Thrombozytenhaftung und Fibrinablagerung charakterisiert. Die Wirkung der Endothelfunktion in der veränderten Thrombusdynamik wird durch Postanalyse durch Immunfluoreszenzfärbung bestimmter Moleküle bestimmt.
Die repräsentativen Ergebnisse beschreiben den Versuchsaufbau, die Datenerfassung und die Datenanalyse. Je nach Forschungsfrage können die Parameter für jeden Abschnitt angepasst werden, einschließlich Zelltyp, Scherraten, Kanalgeometrie, Medikamenttherapie und Postanalyseverfahren. Das Protokoll wird durch Quantifizierung der Thrombusbildung an der Lungenarterieendothel von Patienten mit chronischer thromboembolischer Erkrankung validiert.
Das Endothel bildet die innere Zellschicht der Blutgefäße und trennt Blut vom umgebenden Gewebe. Es wurde als dynamisches Organ beschrieben, das seine Mikroumgebung aktiv reguliert und auf äußere Reize reagiert1. Aufgrund seines direkten Kontakts mit fließendem Blut ist das Endothel bei der Kontrolle von Hämostase und Thrombose von entscheidender Bedeutung und ist die primäre Quelle vieler der wichtigsten regulatorischen Moleküle, die Thrombozytenaggregation, Gerinnung und Fibrinolyse steuern2. Gesunde, nicht aktivierte Endothelzellen (EC) produzieren mehrere Moleküle, die der Thrombozytenaktivierung entgegenwirken und die Gerinnung und Thrombusbildung verhindern, um den Blutfluss aufrechtzuerhalten, wie Prostacyclin, Thrombomodulin oder Gewebefaktor-Signalweg-Inhibitor (TFPI)2,3. Dies verhindert die Haftung von Thrombozyten, Thrombozytenaggregation und Thrombusbildung. Die Verletzung oder Aktivierung der Gefäßwand führt zu einem prokoagulanen endothelialen Phänotyp, der lokalisierte Thrombozytenhaftung und Gerinnselbildung2,4initiiert. Bei endotheliale Aktivierungsplättchen haften sie an von Willebrand Factor (VWF), einem multimerischen Protein, das aus ECs freigesetzt wird, oder an exponierten Bindungsstellen der zugrunde liegenden subendotheliaalen Matrix. Anschließend initiieren molekulare Veränderungen in Thrombozyten und die Exposition gegenüber dem Gewebefaktor (TF) die Aktivierung des Gerinnungssystems, das die Thrombusbildung durch Fibrinpolymerisation5,6induziert. Zusammen bildet das resultierende Gerinnsel die Grundlage für den Wundverschluss durch Reendothelialisierung7. Störungen des Gerinnungssystems können zu Blutungsstörungen wie der von Willebrand-Krankheit, Hämophilie oder Thrombose führen, die oft aus einem dysregulierten pro- und antithrombotischen Gleichgewicht des endotheliaalen hämostatischen Weges2,3resultieren.
Der Prozess der Hämostase tritt sowohl in der arteriellen als auch in der venösen Zirkulation auf. Die Mechanismen, die der arteriellen und venösen Thrombose zugrunde liegen, unterscheiden sich jedoch grundlegend. Während die arterielle Thrombose, wie sie bei ischämischen Herzerkrankungen zu beobachten ist, hauptsächlich durch den Bruch einer atherosklerotischen Plaque unter Bedingungen hoher Scherspannung angetrieben wird, entwickelt sich venöse Thrombose meist in Abwesenheit einer endotheliale Verletzung in einem Zustand der Stasi8,9,10. Ein tiefer Venenthrombus kann sich verminnen und in Richtung der Lungenarterien reisen, wo er eine Lungenembolie verursacht. Dies kann zu chronischen gefäßvaskulären Obstruktionen führen, die zu signifikanten Beeinträchtigungen der funktionellen Fähigkeiten führen, die die Entwicklung von chonischen Lungenerkrankungen, einschließlich der Entwicklung von chronischer thromboembolischer pulmonaler Hypertonie (CTEPH)11,12,13,14. CTEPH zeichnet sich durch erhöhten Lungendruck aufgrund von Verstopfungen der Lungenarterien durch thromboembolisches Material nach mindestens drei Monaten Antikoagulationstherapie15aus. Neben Lungenemboli wird postuliert, dass das lungene Endothel eine prothrombotische Umgebung in CTEPH bietet, die in situ Thrombose und chronische Obstruktionen der Lungenarterien erleichtert, was zu einem Anstieg des Blutdrucks führt, der letztlich zu Herzinsuffizienz führen kann, wenn es unbehandelt16,17.
In den letzten Jahren haben verschiedene Studien zur Entwicklung von Assays zur Untersuchung der Thrombusbildung durch Messung der Thrombozytenfunktion und Gerinnung18geführt. Die meisten von ihnen untersuchen jedoch entweder die Wechselwirkung von Vollblut mit einzelnen extrazellulären Matrixkomponenten wie Kollagenoder oder Fibrasen oder die endotheliale Funktion in Wechselwirkung mit einzelnen Blutbestandteilen, wie Endothel-Thrombolet oder Endothel-Leukozyten-Wechselwirkung19,20,21,22. Diese Assays werden am häufigsten mit menschlichen Nabelvenenen-Endothelzellen (HUVEC) durchgeführt, da diese Zellen leicht erhalten werden können. Hämostatische Gene werden jedoch differenziell über den Gefäßbaum, Gefäßtypen und Organsysteme23,24, exprimiert, was die Verwendung von HUVECs zur Darstellung von Endothelzellen, die an arterieller Thrombose oder Lungenembolien beteiligt sind, problematisch macht23.
Neben der EC-Plastizität können krankheitsspezifische hämodynamische Veränderungen und Veränderungen in der Gefäßmorphologie die Thrombusbildung am normalen Endothel25fördern. Höhere Scherraten, z. B. aufgrund lokaler Vasokonstriktionen oder Veränderungen der Gefäßgeometrie, können zu einer akuten Thrombusbildung führen, was zu einer Stenose führt, die die Einstellung des Blutflusses beschleunigt26. Die Verwendung von maßgeschneiderten mikrotechnischen Durchflusskanälen ermöglicht es, speziell Gefäßgeometrien zu entwerfen, die repräsentativ für die (Patho-)Biologie sind. Auf diese Weise ist es möglich, die Wirkung lokaler biomechanischer Kräfte auf gesunde oder erkrankte EC27zu untersuchen.
Es gibt Antikoagulationstherapien für die Ausrichtung auf verschiedene Phasen und Moleküle in der Gerinnungskaskade, die alle besondere Risiken und Vorteile darstellen, die für bestimmte Störungen spezifisch sein können. Der in diesem Papier beschriebene Ansatz der Krankheitsmodellierung eignet sich besonders, um die Auswirkungen verschiedener Antikoagulations- und Thrombozytentherapien auf die Thrombusdynamik zu testen.
Ziel ist es, ein Thrombosemodell zu präsentieren, das primäre ECs umfasst und ein vielseitiges Modell liefert, das für die Analyse verschiedener Formen der Thrombose geeignet ist, abhängig von der Art der verwendeten primären ECs. Zur Veranschaulichung verwendeten wir pulmonale Arterien-Endothelzellen von CTEPH-Patienten in Wechselwirkung mit ganzem menschlichen Blut, das alle an der Thrombusbildung beteiligten Komponenten (Thrombozyten, Leukozyten, Erythrozyten, Gerinnungsproteine und Kofaktoren) enthält. Dieser Ansatz kann in kommerziellen Parallelflusskanälen oder in kundenspezifischen mikrofluidischen Durchflusskanälen mit einem spezifischen vaskulären Design angewendet werden. Als solches kann das Modell schließlich in der Untersuchung der Thrombusbildung und -auflösung, für die Beurteilung von Entzündungsreaktionen bei der Krankheitsmodellierung, für die Thrombozyten- oder Antikoagulationstherapie und letztlich für die personalisierte Medizin verwendet werden.
Diese Studie beschreibt die Isolierung der primären menschlichen Lungenarterieen-Endothelzellen. Für die Isolierung anderer primärer menschlicher Endothelzelltypen beziehen wir uns auf zuvor veröffentlichte Methoden, einschließlich pulmonaler mikrovaskulärer Endothelzellen25, menschlicher Nabelvenenenenen-Endothelzellen28und blutzirkulierender endothelialer Koloniebildender Zellen Abbildung 1A29.
Die Gerinnung ist das Ergebnis des komplexen und zeitlich gesteuerten Zusammenspiels zwischen Endothel und Blutbestandteilen. Dieser In-vitro-Test stellt eine Methode zur Untersuchung der thrombogenen Eigenschaften von Endothelzellen in Echtzeit dar. Es können verschiedene Arten von primären menschlichen Endothelzellen verwendet werden, die eine In-situ-Thrombose in einer Organ- und patientenspezifischen Weise erleichtern. In dieser Studie haben wir die Verwendung dieses Protokolls veranschaulicht, in dem die thrombogenen Eigenschaften von PAECs verglichen werden, die von gesunden Spendern isoliert wurden, mit CTEPH-Patienten. Die Bildung von Live Thrombus wurde durch Perfusion von Vollblut von gesunden Probanden über Histamin-aktiviertes Endothel untersucht, während die Wirkung eines DOAC als Antithrombotikum getestet wurde.
Neben der Verwendung kommerziell erhältlicher Mikrokanäle, wie in den repräsentativen Ergebnissen dargestellt, ermöglicht die Einführung der maßgeschneiderten mikrofluidischen Kanäle die Untersuchung des Einflusses von Gefäßgeometrieveränderungen auf die Thrombusbildung. Beispielsweise nimmt der Durchfluss an einem Astpunkt ab, oder die Stenose führt zu einer Erhöhung der Scherspannung und mehr Thrombozytenaktivierung36. Eine wesentliche Einschränkung dieser maßgeschneiderten mikrofluidischen Kanäle ist jedoch die Anforderung hoher Zellzahlen, eine stabile Monoschicht von ECs zu bilden, wie in Schritt 2.3.2 beschrieben. Dies kann einen begrenzenden Faktor darstellen, wenn patientenabgeleitete Zellen knapp sind. Die Stärken der kommerziell erhältlichen Mikrorutschen bestehen darin, dass die Oberflächenflächen für die Zellkultur modifiziert werden und Wachstumsbereiche größer sind, wodurch ECs eine konfluente und stabile Monoschicht bilden können. Auf der anderen Seite wird eine größere Fläche zu einem größeren Lumen führen. Gemäß Gleichung 1erfordert dies höhere Blutmengen, um ähnliche Durchflussraten wie in der maßgeschneiderten Mikrofluidik zu erreichen.
Eine Verbesserung dieses Protokolls könnte darin bestehen, lebende EG-Verluste oder Änderungen der Barriereintegrität zu untersuchen. DER EG-Schaden in diesem Protokoll wird erst am Ende des Experiments gemessen. Für Live-Tracking können ECs mit mCherry VE-cadherin markiert werden, z.B.37. Da dies jedoch ein hochoptimiertes Protokoll mit effizienter Virustransfektion benötigen würde, könnte Electric Cell-Substrat Impedanz-Sensing (ECIS) als Alternative zur Untersuchung der endotheliaalen Integrität und Barrierefunktion38verwendet werden. Die Perfusion über spezielle ECIS-Durchflusskanäle ermöglicht die Längsüberwachung der Endothelbarriereintegrität unter Strömung. Diese spezifischen ECIS-Eigenschaften ermöglichen parallele Messungen der Endothelbarriereeigenschaften und der Thrombusbildung. Alternative Möglichkeiten für parallele EC-Barrieremessungen, insbesondere in den kundenspezifischen Arrays, sind die Verwendung von fluoreszierender Dextrans im Perfusaten, die je nach EG-Barriereeigenschaften aus dem Lumen diffundieren.
Eine Einschränkung des beschriebenen Protokolls ist, dass ECs aus dem menschlichen Körper entfernt und auf Gewebekultur Kunststoff kultiviert werden, die ein steifes, künstliches Substrat ist. Zellen passen sich ihrer biophysikalischen Umgebung an. Dies könnte möglicherweise die endotheliale Reaktion auf die Thrombozytenaktivierung beeinflussen, da es einen Zusammenhang zwischen Thrombozytenaktivierung und Wandsteifigkeit39gibt. Trotz dieser Anpassungen an Kulturkunststoffe behalten Zellen krankheitsspezifische Eigenschaften bei, die im direkten Vergleich mit ECs identifiziert werden können, die von gesunden Spendern abgeleitet wurden, wie mit Kontrolle, CTEPH-PAEC und HUVEC gezeigt, die nach 5 min Blutdurchblutung unterschiedliche Muster der Thrombozytenhaftung und Fibrinablagerung ausübten.
Im Gegensatz zu anderen Protokollen verwendet dieses System Vollblut, während andere die EG-Interaktion mit einer einzigen Blutkomponente wie Blutplättchen und Leukozyten19,20,21untersuchen. Es wurden fortschrittlichere mikrofluidische Modelle entwickelt, die die Untersuchung der endotheliaalen Funktion in einem Gefäßmodell mit einer runden Gefäßgeometrie und weicher extrazellulärer Matrix ermöglichen. Diese sind jedoch mit HUVECs40,41,42optimiert. Die Neuheit des beschriebenen Protokolls ist die Verwendung von primären ECs in Kombination mit Vollblut, die die Modellierung der In-situ-Thrombose einen Schritt näher an in vivo-Bedingungen bringt. Das Protokoll für den Einsatz von patientenabgeleiteten ECs und patientenabgeleitetem Blut optimiert die Krankheitsmodellierung in vitround ermöglicht die Beurteilung der personalisierten Thrombusbildung und medikamentösen Behandlung.
Das beschriebene Protokoll kann angewendet werden, um die Wirkung von Antikoagulationstherapien auf patientenabgeleitete Zellen zu untersuchen. Während wir Dabigatran verwendet haben, um die Thrombusbildung zu hemmen, ist es möglich, andere Antikoagulanzien wie Rivaroxaban zu verwenden, das den Faktor Xa in der Gerinnungskaskade direkt hemmt. Auch Direktplättchenhemmer wie Clopidogrel oder Aspirin können untersucht werden, da diese auf die primäre Phase der Hämostase wirken, in der Thrombozyten an ECs binden. Letztlich können die thrombogenen Kapazitäten patientenspezifischer ECs in Wechselwirkung mit dem eigenen Blut des Patienten genutzt werden, um die persönliche Wirkung der Antikoagulationstherapie auf den einzelnen Patienten vorherzusagen. Darüber hinaus kann ein Knockdown spezifischer Proteine zusätzliche funktionelle Informationen liefern.
Es gibt einige Schritte im beschriebenen Protokoll, die für ein erfolgreiches Perfusionsexperiment entscheidend sind. Erstens ist es bei der Isolierung von Primärzellen notwendig, eine hochreine EG-Kultur zu erhalten. Zweitens ist es wichtig, dass die ECs eine stabile konfluente Monoschicht bilden. Ist dies nicht der Fall, kann eine leichte Änderung der Scherspannung zu Endothelschäden und Aktivierung der Gerinnungskaskade führen, oder Thrombozyten können mit der Bindung an die Kellermembran beginnen, was zu falschen positiven Ergebnissen führt. Drittens ist es wichtig, Luftblasen zu verhindern, da diese das Endothel schädigen und dadurch die Ergebnisse beeinflussen können.
Nach der Verkalkung des citrated Blutes mit Calciumchlorid und Magnesiumchlorid ist es wichtig, sofort mit dem Perfusionsexperiment zu beginnen. Die Verkalkung induziert eine schnelle Reaktion bei der Thrombozytenaktivierung und Thrombusbildung, was zu einer schnellen Gerinnung in der Probe führt.
Abschließend beschreiben wir ein sehr vielseitiges Protokoll zur Untersuchung von Wechselwirkungen mit Blut-endotheliaalen Zellen während der Thrombose.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Jan Voorberg vom Department of Plasma Proteins, Sanquin Research and Landsteiner Laboratory, Amsterdam UMC, Academic Medical Center, Amsterdam, Niederlande, für seinen Beitrag zu diesem Manuskript. Diese Arbeit wurde von der Niederländischen CardioVascular Alliance (DCVA) [2012-08, 2014-11] unterstützt, die an das Phaedra- und das Reconnect-Konsortium vergeben wurde, sowie vom Impulse-Stipendium 2018, das dem Phaedra IMPACT-Konsortium gewährt wurde. Diese Stipendien umfassen die kollektive Finanzierung durch die Niederländische Herzstiftung, die Niederländische Föderation der Universitätskliniken, die niederländische Organisation für Gesundheitsforschung und -entwicklung und die Königlich Niederländische Akademie der Wissenschaften. Darüber hinaus wurde diese Arbeit vom Europäischen Forschungsrat im Rahmen des Advanced Grant ‘VESCEL’-Programms (Grant-Nummer: 669768) finanziert. XDM wird durch ein Forschungsstipendium des Instituts für Kardiovaskuläre Forschung (ICaR-VU) am VU University Medical Center, Amsterdam, Niederlande, gefördert.
20 mL syringe | BD Plastipak | 300613 | |
20X objective | Olympus | ||
2-Propanol (IPA) | Boom | 76051455 . 5000 | |
Aladdin Syringe Pump | Word Precision Instruments | AL-4000 | |
Alexa488-Fibrinogen | Invitrogen | F13191 | 15 ug/mL |
Alexa647 Goat anti Rabbit | Invitrogen | A21245 | 0.180555556 |
Biopsy punch 1 mm diameter, Integra Miltex | Ted Pella | 15110-10 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A9647 | |
CaCl2 | Sigma Aldrich | 21115 | |
Calcein AM-Red | Invitrogen | C3099 | 1:1000 |
CD42b-APC | Miltenyi Biotec | 130-100-208 | 1:100 |
Citric Acid | Merck | 244 | |
Collagen Typ I | Corning | 354249 | 0,1 mg/mL |
Corning CellBIND Surface 60 mm Culture Dish | Corning | 3295 | |
Cross-flow hood | Basan | ||
Desiccator | Duran | 24 782 69 | |
D-Glucose | Merck | 14431-43-7 | |
EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
Endothelial Cell Medium (ECM) | ScienCell | 1001 | |
Fibronectin | Sigma Aldrich | F0895 | |
Flow tubings | ibidi | 10831, 10841 | |
Gelatin | Merck | 104070 | 0.1% |
HEPES | Sigma Aldrich | H4034 | |
Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | 1:1000 |
ibidi µ-Slide VI 0.4 flow chambers | ibidi | 80606 | |
ImageJ | ImageJ | v1.49 | |
KCl | Merck | 7447-40-7 | |
Lab oven | Quincy | 10GC | |
LS720 Fluorescent microscope | etaluma | LS720 | |
Luer connector | ibidi | 10802, 10825 | Male elbow connectors, and Female tube connectors |
MACS magnetic beads (anti-CD144) | Miltenyi Biotec | 130-097-857 | 1:5 |
MgCl2 | Sigma Aldrich | M1028 | |
Microscopy slides, 76 x 26 mm | Thermo Scientific | AAAA000001##12E | |
Negative photoresist, SU-8 | Microchem | ||
Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Lonza | 13-114E | |
Paraformaldehyde (PFA) | Merck | 818715 | 4% PFA in PBS |
Penicillin/streptomycin (P/S) | Gibco | 15140-122 | 1% |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-094 | |
Plasma chamber, CUTE | Femto Science | ||
Polydimethylsiloxane (PDMS), Sylgard 184 | Dow | 101697 | |
sodium citrate blood collection tubes | BD Vacutainer | 363048 | |
trisodium citrate | Merck | 6448 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300-045 | |
VE-Cadherin (D87F2)-XP | Cell Signaling | 2500 | 1:300 |