Summary

Indagine sul metabolismo degli xenobiotici nelle foglie di Alba Salix tramite imaging della spettrometria di massa

Published: June 15, 2020
doi:

Summary

Questo metodo utilizza l’imaging della spettrometria di massa (MSI) per comprendere i processi metabolici nelle foglie di S. alba quando esposte agli xenobiotici. Il metodo consente la localizzazione spaziale dei composti di interesse e dei loro metaboliti previsti all’interno di tessuti specifici e intatti.

Abstract

Il metodo presentato utilizza l’imaging della spettrometria di massa (MSI) per stabilire il profilo metabolico delle foglie di S. alba quando esposte agli xenobiotici. Utilizzando un approccio non mirato, i metaboliti vegetali e gli xenobiotici di interesse sono identificati e localizzati nei tessuti vegetali per scoprire specifici modelli di distribuzione. Quindi, nella previsione silico dei potenziali metaboliti (cioè cataboliti e coniugati) dagli xenobiotici identificati viene eseguita. Quando un metabolita xenobiotico si trova nel tessuto, viene registrato il tipo di enzima coinvolto nella sua alterazione da parte della pianta. Questi risultati sono stati utilizzati per descrivere diversi tipi di reazioni biologiche che si verificano nelle foglie di S. alba in risposta all’accumulo xenobiotico nelle foglie. I metaboliti sono stati previsti in due generazioni, permettendo la documentazione delle successive reazioni biologiche per trasformare gli xenobiotici nei tessuti fogliari.

Introduction

Gli xenobiotici sono ampiamente distribuiti in tutto il mondo a causa delle attività umane. Alcuni di questi composti sono solubili in acqua e assorbitidal suolo 1e entrano nella catena alimentare quando si accumulano nei tessutivegetali 2,3,4. Le piante vengono mangiate da insetti ed erbivori, che sono preda di altri organismi. L’assunzione di alcuni xenobiotici e il loro impatto sulla salute di una pianta sono statidescritti 5,6,7,8, ma solo di recente a livello di tessuto9. Pertanto, non è ancora chiaro dove o come si verifichi il metabolismo degli xenobiotici, o se specifici metaboliti vegetali sono correlati all’accumulo xenobiotico in tessutispecifici 10. Inoltre, la maggior parte delle ricerche ha trascurato il metabolismo degli xenobiotici e dei loro metaboliti nelle piante, quindi si sa poco di queste reazioni nei tessuti vegetali.

Qui viene proposto un metodo per studiare le reazioni enzimatiche in campioni biologici che possono essere associati alla localizzazione tissutale di substrati e prodotti delle reazioni. Il metodo può disegnare il profilo metabolico completo di un campione biologico in un esperimento, poiché l’analisi non è mirata e può essere studiata utilizzando elenchi personalizzati di aliti di interesse. Fornito è un elenco di candidati monitorati nel set di dati originale. Se nel campione vengono annotato uno o più aaliti di interesse, la localizzazione specifica dei tessuti può fornire informazioni importanti sui relativi processi biologici. Gli aliti di interesse possono quindi essere modificati in silico utilizzando le leggi biologiche pertinenti per cercare possibili prodotti/metaboliti. L’elenco dei metaboliti ottenuti viene quindi utilizzato per analizzare i dati originali identificando gli enzimi coinvolti e localizzando le reazioni nei tessuti, aiutando così a comprendere i processi metabolici che si verificano. Nessun altro metodo fornisce informazioni sui tipi di reazioni che si verificano nei campioni biologici, sulla localizzazione dei composti di interesse e sui relativi metaboliti. Questo metodo può essere utilizzato su qualsiasi tipo di materiale biologico una volta disponibili tessuti freschi e intatti e i composti di interesse possono essere ionizzati. Il protocollo proposto è stato pubblicato a Villette etal.

Protocol

1. Preparazione del campione Ottenere il campione biologico e mantenerlo fresco e intatto (ad esempio, non costringerlo in un tubo) o congelarlo. Il protocollo proposto si applica a qualsiasi tipo di campione biologico solido (cioè tessuti vegetali, animali o umani) per localizzare composti in tessuti specifici. Raffreddare un criomicrotomo a -20 °C. Mantenere il portacampioni e la lama alla stessa temperatura. Se necessario, incorporare l’oggetto nel mezzo di incorporamento M1 per preser…

Representative Results

Questo protocollo è stato applicato alle foglie fresche campionare da un albero di S. alba esposto agli xenobiotici nell’ambiente. Il processo è illustrato nella figura 1. Il primo passo è preparare sottili fette del campione di interesse. I campioni vegetali sono spesso più difficili da tagliare rispetto ai campioni animali, in quanto i tessuti sono eterogenei e possono contenere acqua e / o aria. Questa difficoltà viene gestita utilizzando un supporto di incorporamento, che f…

Discussion

La parte critica di questo protocollo è la preparazione del campione: il campione deve essere morbido e intatto. Il taglio è la parte più difficile, in quanto la temperatura e lo spessore del campione possono variare a seconda del tipo di campione studiato. I tessuti animali sono solitamente omogenei e più facili da tagliare. I campioni vegetali spesso incorporano strutture diverse e quindi sono più difficili da mantenere intatti poiché la lama incontra tessuti vascolari morbidi, duri o vuoti. Si consiglia vivament…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo Charles Pineau, Mélanie Lagarrigue e Régis Lavigne per i loro suggerimenti e trucchi riguardanti la preparazione del campione per l’imaging MALDI di campioni vegetali.

Materials

Cover slips Bruker Daltonics 267942
Cryomicrotome Thermo Scientific
Excel Microsoft corporation
flexImaging Bruker Daltonics
ftmsControl Bruker Daltonics
GTX primescan GX Microscopes
HCCA MALDI matrix Bruker Daltonics 8201344
ImagePrep Bruker Daltonics
ITO-coated slides Bruker Daltonics 237001
M1-embedding matrix ThermoScientific 1310
Metabolite Predict Bruker Daltonics
Metaboscape Bruker Daltonics
Methanol Fisher Chemicals No specific reference needed
MX 35 Ultra blades Thermo Scientific 15835682
Plastic molds No specific reference needed
SCiLS Lab Bruker Daltonics
SolariX XR 7Tesla Bruker Daltonics The method proposed is not limited to this instrument
Spray sheets for ImagePrep Bruker Daltonics 8261614
TFA Sigma Aldrich No specific reference needed

References

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Cite This Article
Villette, C., Maurer, L., Heintz, D. Investigation of Xenobiotics Metabolism In Salix alba Leaves via Mass Spectrometry Imaging. J. Vis. Exp. (160), e61011, doi:10.3791/61011 (2020).

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