Summary

חקירת חילוף החומרים של קסנוביוטיקה בעלי אלבה סליקס באמצעות הדמיה ספקטרומטרית מסה

Published: June 15, 2020
doi:

Summary

שיטה זו משתמשת בהדמיית ספקטרומטריית מסה (MSI) כדי להבין תהליכים מטבוליים בעלי S. alba כאשר הם נחשפים לשנאת קסנוביוטיקה. השיטה מאפשרת לוקליזציה מרחבית של תרכובות מעניינות ואת המטבוליטים החזויים שלהם בתוך רקמות ספציפיות ושלמות.

Abstract

השיטה המוצגת משתמשת בהדמיית ספקטרומטריית מסה (MSI) כדי לקבוע את הפרופיל המטבולי של עלי ס. אלבה כאשר הם נחשפים לשנאת קסנוביוטיקה. באמצעות גישה לא ממוקדת, מטבוליטים צמחיים ושנאת זרים של עניין מזוהים ומקומיים ברקמות הצמח כדי לחשוף דפוסי הפצה ספציפיים. לאחר מכן, בחיזוי סיליקו של מטבוליטים פוטנציאליים (כלומר, קטבוליטים ומצוות) מן xenobiotics מזוהה מבוצע. כאשר מטבוליט xenobiotic ממוקם ברקמה, סוג של אנזים המעורב בשינוי שלה על ידי הצמח נרשם. תוצאות אלה שימשו לתיאור סוגים שונים של תגובות ביולוגיות המתרחשות עלים S. אלבה בתגובה הצטברות xenobiotic בעלים. המטבוליטים חזו בשני דורות, מה שאיפשר לתיעוד של תגובות ביולוגיות רצופות להפוך קסנוביוטיקה ברקמות העלים.

Introduction

Xenobiotics מופצים באופן נרחב ברחבי העולם בשל פעילות אנושית. חלק מהתרכובות הללו מסיסות במים ונספגות באדמה1, ונכנסות לשרשרת המזון כאשר הן מצטברות ברקמות צמחיות2,3,4. הצמחים נאכלים על ידי חרקים ואוכלי עשב, שהם טרף לאורגניזמים אחרים. צריכת כמה xenobiotics והשפעתם על בריאותו של הצמח תוארו5,6,7,8, אבל רק לאחרונה ברמת רקמה9. לכן, עדיין לא ברור איפה או איך חילוף החומרים של xenobiotics מתרחשת, או אם מטבוליטים צמחיים ספציפיים מתואמים הצטברות xenobiotic ברקמות ספציפיות10. יתר על כן, רוב המחקר התעלם חילוף החומרים של xenobiotics ואת המטבוליטים שלהם בצמחים, כל כך מעט ידוע על תגובות אלה ברקמות הצמח.

מוצעת כאן שיטה לחקור תגובות אנזימטיות בדגימות ביולוגיות שיכולות להיות קשורות לוקליזציה רקמה של מצעים ומוצרים של התגובות. השיטה יכולה לצייר את הפרופיל המטבולי המלא של מדגם ביולוגי בניסוי אחד, שכן הניתוח אינו ממוקד וניתן לחקור אותו באמצעות רשימות מותאמות אישית של אנליטים מעניינים. מסופקת רשימה של מועמדים במעקב בקבוצת הנתונים המקורית. אם מנתח אחד או יותר של עניין מצוינים במדגם, לוקליזציה הרקמה הספציפית יכולה לספק מידע חשוב על התהליכים הביולוגיים הקשורים. ניתוח עניין לאחר מכן ניתן לשנות silico באמצעות חוקים ביולוגיים רלוונטיים כדי לחפש מוצרים אפשריים / מטבוליטים. רשימת המטבוליטים המתקבלים משמשת לאחר מכן לניתוח הנתונים המקוריים על ידי זיהוי האנזימים המעורבים ו לוקליזציה של התגובות ברקמות, ובכך מסייע להבין את התהליכים המטבוליים המתרחשים. אף שיטה אחרת אינה מספקת מידע על סוגי התגובות המתרחשות בדגימות הביולוגיות, לוקליזציה של תרכובות מעניינות, ומטבוליטים הקשורים אליהן. שיטה זו יכולה לשמש על כל סוג של חומר ביולוגי פעם רקמות טריות ושלמות זמינים ואת תרכובות של עניין ניתן ליינן. הפרוטוקול המוצע פורסם ב-Villette et al.12 ומפורט כאן לשימוש הקהילה המדעית.

Protocol

1. הכנה לדוגמה להשיג את הדגימה הביולוגית או לשמור אותו טרי ושלם (למשל, לא לכפות אותו לתוך צינור) או להקפיא אותו. הפרוטוקול המוצע חל על כל סוג של מדגם ביולוגי מוצק (כלומר, רקמות צמחיות, בעלי חיים או אנושיות) כדי להתאים תרכובות ברקמות ספציפיות. מצננים קריומיקרוטום ל-20 מעלות צלזיוס. שמ…

Representative Results

פרוטוקול זה הוחל על עלים טריים שנדגמו מעץ ס. אלבה שנחשף לשנאת קסנוביוטיקה בסביבה. התהליך מתואר באיור 1. הצעד הראשון הוא להכין פרוסות דקות של מדגם של עניין. דגימות צמחים הן לעתים קרובות קשה יותר לחתוך מאשר דגימות בעלי חיים, כמו הרקמות הטרוגניות והוא יכול להכיל מים ו / או א…

Discussion

החלק הקריטי של פרוטוקול זה הוא הכנת המדגם: המדגם חייב להיות רך ושלם. חיתוך הוא החלק הקשה ביותר, שכן הטמפרטורה ועובי המדגם יכולים להשתנות בהתאם לסוג המדגם שנחקר. רקמות בעלי חיים הן בדרך כלל הומוגניות וקל יותר לחתוך. דגימות צמחים לעתים קרובות לשלב מבנים שונים ולכן קשה יותר לשמור על שלם כמו הל?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים לצ’ארלס פינאו, מלאני לגריג ורגיס לאבין על הטיפים והטריקים שלהם לגבי הכנת מדגם להדמיית MALDI של דגימות צמחים.

Materials

Cover slips Bruker Daltonics 267942
Cryomicrotome Thermo Scientific
Excel Microsoft corporation
flexImaging Bruker Daltonics
ftmsControl Bruker Daltonics
GTX primescan GX Microscopes
HCCA MALDI matrix Bruker Daltonics 8201344
ImagePrep Bruker Daltonics
ITO-coated slides Bruker Daltonics 237001
M1-embedding matrix ThermoScientific 1310
Metabolite Predict Bruker Daltonics
Metaboscape Bruker Daltonics
Methanol Fisher Chemicals No specific reference needed
MX 35 Ultra blades Thermo Scientific 15835682
Plastic molds No specific reference needed
SCiLS Lab Bruker Daltonics
SolariX XR 7Tesla Bruker Daltonics The method proposed is not limited to this instrument
Spray sheets for ImagePrep Bruker Daltonics 8261614
TFA Sigma Aldrich No specific reference needed

References

  1. Zhang, D., Gersberg, R. M., Ng, W. J., Tan, S. K. Removal of pharmaceuticals and personal care products in aquatic plant-based systems: A review. Environmental Pollution. 184, 620-639 (2014).
  2. Adeel, M., Song, X., Wang, Y., Francis, D., Yang, Y. Environmental impact of estrogens on human, animal and plant life: A critical review. Environment International. 99, 107-119 (2017).
  3. Prosser, R. S., Sibley, P. K. Human health risk assessment of pharmaceuticals and personal care products in plant tissue due to biosolids and manure amendments, and wastewater irrigation. Environment International. 75, 223-233 (2015).
  4. Wang, J., et al. Application of biochar to soils may result in plant contamination and human cancer risk due to exposure of polycyclic aromatic hydrocarbons. Environment International. 121, 169-177 (2018).
  5. Marsik, P., et al. Metabolism of ibuprofen in higher plants: A model Arabidopsis thaliana cell suspension culture system. Environmental Pollution. 220, 383-392 (2017).
  6. He, Y., et al. Metabolism of ibuprofen by Phragmites australis: uptake and phytodegradation. Environmental Science and Technology. 51 (8), 4576-4584 (2017).
  7. Huber, C., Bartha, B., Harpaintner, R., Schröder, P. Metabolism of acetaminophen (paracetamol) in plants-two independent pathways result in the formation of a glutathione and a glucose conjugate. Environmental Science and Pollution Research. 16 (2), 206-213 (2009).
  8. Thomas, F., Cébron, A. Short-term rhizosphere effect on available carbon sources, phenanthrene degradation, and active microbiome in an aged-contaminated industrial soil. Frontiers in Microbiology. 7, 1-15 (2016).
  9. Villette, C., et al. In situ localization of micropollutants and associated stress response in Populus nigra leaves. Environment International. 126, 523-532 (2019).
  10. Sandermann, H. Plant metabolism of organic xenobiotics. Status and prospects of the ‘Green Liver’ concept. Plant Biotechnology and In Vitro Biology in the 21st Century. , 321-328 (1999).
  11. Sula, B., Deveci, E., Özevren, H., Ekinci, C., Elbey, B. Immunohistochemical and histopathological changes in the skin of rats after administration of lead acetate. International Journal of Morphology. 34 (3), 918-922 (2016).
  12. Villette, C., Maurer, L., Wanko, A., Heintz, D. Xenobiotics metabolization in Salix alba leaves uncovered by mass spectrometry imaging. Metabolomics. 15, 122 (2019).
  13. Khatib-Shahidi, S., Andersson, M., Herman, J. L., Gillespie, T. A., Caprioli, R. M. Direct Molecular Analysis of Whole-Body Animal Tissue Sections by Imaging MALDI Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 78 (18), 6448-6456 (2006).

Play Video

Cite This Article
Villette, C., Maurer, L., Heintz, D. Investigation of Xenobiotics Metabolism In Salix alba Leaves via Mass Spectrometry Imaging. J. Vis. Exp. (160), e61011, doi:10.3791/61011 (2020).

View Video