Summary

Generación de oligodendrocitos y medio condicionado por oligodendrocitos para experimentos de cocultura

Published: February 09, 2020
doi:

Summary

En este documento, mostramos un método eficiente para la purificación de oligodendrocitos y la producción de medio condicionado por oligodendrocitos que se puede utilizar para experimentos de cocultivo.

Abstract

En el sistema nervioso central, los oligodendrocitos son bien conocidos por su papel en la mielinización de axón, que acelera la propagación de potenciales de acción a través de la conducción saltatoria. Por otra parte, un número creciente de informes sugieren que los oligodendrocitos interactúan con las neuronas más allá de la mielinización, en particular a través de la secreción de factores solubles. Aquí, presentamos un protocolo detallado que permite la purificación de células de linaje oligodendroglial de cultivos celulares gliales que también contienen astrocitos y células microgliales. El método se basa en el temblor nocturno a 37 oC, que permite el desprendimiento selectivo de las células oligodendrogliales y microglia superpuestas, y la eliminación de la microglia por adhesión diferencial. A continuación, describimos el cultivo de oligodendrocitos y la producción de medio condicionado por oligodendrocitos (OCM). También proporcionamos la cinética del tratamiento OCM u oligodendrocitos adición a las neuronas hipocampales purificadas en experimentos de cocultivo, estudiando interacciones oligodendrocitos-neuronas.

Introduction

Los oligodendrocitos (OL) son células gliales del sistema nervioso central (SNC) que generan envoltura de mielina alrededor de los axones. Los OL s originan a partir de células precursoras de oligodendrocitos (OPO) que proliferan dentro de las zonas ventriculares del SNC embrionario y luego migran y diferencian en OLs completamente maduras (es decir, células formadoras de mielina)1. Los OPO son abundantes durante el desarrollo temprano, pero también persisten en el cerebro adulto donde representan la mayor población celular proliferativa2. Un solo OL envuelve múltiples axones en secciones no excitables (es decir, internodos), y el borde de cada bucle de mielina se une al axón formando el dominio paranodal que es crucial para las propiedades aislantes de la mielina1,3. Entre los paranodos hay pequeños huecos no mielinizados llamados los nodos de Ranvier. Estos nodos son ricos en canales de sodio (Nav) cerrados por voltaje, lo que permite la regeneración y rápida propagación de potenciales de acción a través de la conducción saltatoria4. Esta estrecha interacción también permite el apoyo de la energía axonal a través de la toma neuronal de lactato de OLs5,6.

La maduración de las células de linaje oligodendroglial y el proceso de mielinización están estrechamente regulados por sus interacciones con las neuronas7. De hecho, los OL y los OPO, también llamados células NG2, expresan una serie de receptores de neurotransmisores, y pueden recibir información de las neuronas excitatorias e inhibitorias, lo que les permite sentir la actividad neuronal que puede desencadenar su proliferación y / o diferenciación en las células mielinizadoras2. A su vez, los OPO/OLs secretan microvesículas y proteínas en el espacio extracelular que solo o sinérgicamente median las funciones neuromoduladoras y neuroprotectoras8,9,10,11,12. Sin embargo, los mecanismos moleculares que controlan los múltiples modos de interacciones entre las células de linaje oligodendroglial y las neuronas aún no se han descifrado completamente.

Por otra parte, en varias condiciones patológicas del SNC, los OLs se ven afectados principalmente, lo que perturba su interacción con las neuronas. Por ejemplo, en la Esclerosis Múltiple (EP), la disfunción neurológica es causada por la desmielinización focal en el SNC, secundaria a la pérdida de OLs que puede conducir a daño axonal y acumulación de discapacidad relacionada. La remielinización puede tener lugar, aunque insuficientemente en la mayoría de los casos13. Los progresos en la última década, debido al desarrollo de inmunoterapias, han reducido la tasa de recaídas, pero la promoción de la remielinización sigue siendo hasta la fecha una necesidad insatisfecha. Como tal, una mejor comprensión del papel, las funciones y las influencias de los ostales es de particular interés para el desarrollo de nuevas terapias para un amplio espectro de condiciones del SNC.

Aquí, describimos los métodos de purificación y cultivo de OLs. Esto permite un examen preciso de los mecanismos intrínsecos que regulan su desarrollo y biología. Además, estos cultivos de OLs altamente enriquecidos permiten la producción de medio condicionado por oligodendrocitos (OCM), que se puede agregar a los cultivos de neuronas purificadas para obtener información sobre el impacto de los factores secretos por OLs en la fisiología neuronal y la conectividad. Además, describimos cómo implementar un sistema de cocultivo in vitro donde se combinan oligodendrocitos y neuronas purificados, lo que permite abordar los mecanismos que regulan (re)mielinización.

Protocol

El cuidado y uso de ratas en este experimento se ajusta a las políticas y directrices institucionales (UPMC, INSERM y la Directiva 86/609/CEE del Consejo de la Comunidad Europea). El siguiente protocolo se establece para una camada estándar de 12 cachorros. 1. Preparación de los matraces (5 min) NOTA: Realice los siguientes pasos el día antes de la disección en una campana de flujo laminar en condiciones estériles. Recubrir los matraces de 150 cm<sup…

Representative Results

En este protocolo, las células de linaje OL se purifican de cultivos gliales sacudiendo astrocitos y microglia. La pureza y el examen fenotípico de los cultivos de OL se pueden evaluar mediante inmunomancha con marcadores gliales15. El análisis de la expresión de diferentes marcadores indicó que los cultivos de OL eran en su mayoría pre-OLs con 90% – 4% de O4+ células, 85% – 7% NG2+ células, y 4.7% a 2.1% de PLP+ células, m…

Discussion

Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para obtener cultivos celulares de linaje oligodendroglial altamente enriquecidos a partir de cultivos glialmixtos, adaptados a partir de un método publicado previamente16,y la posterior producción de medio condicionado por OL. Esta técnica de agitación no es costosa, se puede repetir tres veces y es óptima para obtener una gran cantidad de obsturas purificadas, ya que proliferan las células cultivadas en el medio Bottenstein-Sato (BS) que contien…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores quieren agradecer a Rémi Ronzano por su sabio consejo en la edición de manuscritos. Este trabajo fue financiado por iCM, INSERM, la fundación ARSEP a NSF, y el precio Bouvet-Labruyére.

Materials

5-fluorodeoxyuridine Sigma F0503
B27 supplement ThermoFisher 17504044
D-(+)-Glucose solution Sigma G8769
DNase (Deoxyribonuclease I) Worthington LS002139
Dulbecco's Modified Eagle Medium ThermoFisher 31966021
Ethanol 100% Sigma 32221-M
Ethanol 70% VWR Chemicals 83801.360
Fetal Calf Serum ThermoFisher 10082147
L-cysteine Sigma C7352
Neurobasal ThermoFisher 21103049
Papain Worthington LS003126
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher 15140122
Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium ThermoFisher A1285601
Polyethylenimine(PEI) Sigma P3143
Tetraborate decahydrate Sigma B9876
Trypsin Sigma Sigma
Uridine Sigma U3750
Bottenstein-Sato (BS) media
apo-Transferrin human Sigma T1147
BSA (Bovine Serum Albumin) Sigma A4161
Dulbecco's Modified Eagle Medium ThermoFisher 31966021
Insulin Sigma I5500
PDGF Peprotech AF-100-13A
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher 15140122
Progesterone Sigma P8783
Putrescine dihydrochloride Sigma P5780
Sodium selenite Sigma S5261
T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt) Sigma T6397
T4 (L-Thyroxine) Sigma T1775
Co-culture media
apo-Transferrin human Sigma T1147
B27 supplement ThermoFisher 17504044
Biotin Sigma B4639
BSA (Bovine Serum Albumin) Sigma A4161
Ceruloplasmin Sigma 239799
Dulbecco's Modified Eagle Medium ThermoFisher 31966021
Hydrocortisone Sigma H4001
Insulin Sigma I5500
N-Acetyl-L-cysteine Sigma A8199
Neurobasal ThermoFisher 21103049
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher 15140122
Progesterone Sigma P8783
Putrescin Sigma P5780
Recombinant Human CNTF Sigma 450-13
Sodium selenite Sigma S5261
T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt) Sigma T6397
Vitamin B12 Sigma V6629
Tools
0.22 µm filter Sartorius 514-7010
1 mL syringe Terumo 1611127
100 mm Petri dish Dutscher 193100
15 mL tube Corning Life Science 734-1867
50 mL tube Corning Life Science 734-1869
60 mm Petri dish Dutscher 067003
70 µm filter Miltenyi Biotec 130-095-823
Binocular microscope Olympus SZX7
Curved forceps Fine Science Tools 11152-10
Fine forceps Fine Science Tools 91150-20
Large surgical scissors Fine Science Tools 14008-14
Scalpel Swann-morton 233-5528
Shaker Infors HT
Small surgical scissors Fine Science Tools 91460-11
Small surgical spoon Bar Naor Ltd BN2706
T150 cm2 flask with filter cap Dutscher 190151
Animal
P2 Wistar rat Janvier RjHAn:WI

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Cite This Article
Mazuir, E., Dubessy, A., Wallon, L., Aigrot, M., Lubetzki, C., Sol-Foulon, N. Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments. J. Vis. Exp. (156), e60912, doi:10.3791/60912 (2020).

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