Generatie oligodendrocyten en oligodendrocyte-geconditioneerde medium voor co-cultuurexperimenten
Summary
Hierin tonen we een efficiënte methode voor de zuivering van oligodendrocyten en de productie van oligodendrocyte-geconditioneerde medium dat kan worden gebruikt voor co-cultuur experimenten.
Abstract
In het centrale zenuwstelsel staan oligodendrocyten bekend om hun rol in axonmyelinatie, die de voortplanting van actiemogelijkheden versnelt door middel van zoutotoergedrag. Bovendien, een toenemend aantal rapporten suggereren dat oligodendrocyten interageren met neuronen buiten myelinatie, met name door de afscheiding van oplosbare factoren. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol waarmee zuivering van oligodendrogliale afstammingscellen uit gliacelculturen ook astrocyten en microgliale cellen bevat. De methode is gebaseerd op ‘s nachts schudden bij 37 °C, waardoor selectieve onthechting van de bovenliggende oligodendrogliale cellen en microgliacellen, en de eliminatie van microglia door differentiële hechting. Vervolgens beschrijven we de cultuur van oligodendrocyten en de productie van oligodendrocyte-geconditioneerd medium (OCM). We bieden ook de kinetiek van OCM behandeling of oligodendrocyten naast gezuiverde hippocampal neuronen in co-cultuur experimenten, het bestuderen van oligodendrocyte-neuron interacties.
Introduction
Oligodendrocyten (OLs) zijn gliacellen van het centrale zenuwstelsel (CNS) die myeline wikkelen rond axonen genereren. OLs zijn afkomstig van oligodendrocyte precursorcellen (OPC’s) die zich vermenigvuldigen binnen de ventriculaire zones van de embryonale CNS en vervolgens migreren en differentiëren tot volledig volwassen OLs (d.w.z. myelinevormende cellen)1. OPC’s zijn overvloedig aanwezig tijdens de vroege ontwikkeling, maar ook blijven bestaan in de volwassen hersenen waar ze vertegenwoordigen de belangrijkste proliferative cel bevolking2. Een enkele OL ensheathes meerdere axonen in niet-prikkelbare secties (dat wil zeggen, internodes), en de rand van elke myeline lus hecht aan de axon vormen van het paranodale domein dat cruciaal is voor de isolerende eigenschappen van myeline1,3. Tussen de paranodes zijn kleine ongeelde gaten genaamd de knooppunten van Ranvier. Deze knooppunten zijn rijk aan voltage-gated natriumkanalen (Nav), waardoor de regeneratie en snelle verspreiding van actiemogelijkheden door middel van saltatory geleiding4. Deze nauwe interactie maakt ook axonale energieondersteuning mogelijk door middel van neuronale opname van lactaat van OLs5,6.
De rijping van oligodendrogliale lineagecellen en het myelinatieproces worden strak gereguleerd door hun interacties met neuronen7. Inderdaad, OLs en OPC’s, ook wel NG2-cellen, uitdrukken een scala aan receptoren voor neurotransmitters, en kan input ontvangen van excitatory en remmende neuronen, waardoor ze neuronale activiteit die hun proliferatie en / of differentiatie kan leiden tot myeliniserende cellen2voelen. Op zijn beurt scheiden OPC’s/OLs microvesicles en eiwitten af in de extracellulaire ruimte die alleen al neuromodulatieve en neuroprotectieve functies8,9,10,11,12bemiddelt. De moleculaire mechanismen die de verschillende vormen van interacties tussen oligodererogliale lineagecellen en neuronen regelen, moeten echter nog volledig worden ontcijferd.
Bovendien worden ols in verschillende CNS-pathologische omstandigheden voornamelijk beïnvloed, waardoor hun interactie met neuronen wordt verstoord. Bijvoorbeeld, bij Multiple Sclerose (MS), neurologische disfunctie wordt veroorzaakt door focale demyelinatie in de CNS, secundair aan OLs verlies dat kan leiden tot axonale schade en aanverwante invaliditeitaccumulatie. Remyelinatie kan plaatsvinden, zij het onvoldoende in de meeste gevallen13. Vooruitgang in het afgelopen decennium, als gevolg van de ontwikkeling van immunotherapieën, hebben het terugvalpercentage verminderd, maar het bevorderen van remyelinatie blijft tot op heden een onvervulde behoefte. Als zodanig is een beter begrip van ols-rol, functies en invloeden van bijzonder belang voor de ontwikkeling van nieuwe therapieën voor een breed spectrum van CNS-aandoeningen.
Hier beschrijven we de methoden van OLs zuivering en cultuur. Dit maakt nauwkeurig onderzoek mogelijk van intrinsieke mechanismen die hun ontwikkeling en biologie reguleren. Bovendien maken dergelijke hoogverrijkte OLs-culturen de productie mogelijk van oligodendrocyte-geconditioneerd medium (OCM), dat kan worden toegevoegd aan gezuiverde neuronculturen om inzicht te krijgen in de impact van OLs-geafscheideerde factoren op neuronale fysiologie en connectiviteit. Verder beschrijven we hoe we een in vitro co-cultuursysteem implementeren waarbij gezuiverde oligodendrocyten en neuronen worden gecombineerd, waardoor de mechanismen die (her)myelinatie reguleren, kunnen worden aangepakt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor het verkrijgen van hoogverrijkte oligodendrogliale lijncelculturen uit gemengde gliaculturen, aangepast aan een eerder gepubliceerde methode16, en de daaropvolgende productie van OL-geconditioneerd medium. Deze schudtechniek is niet duur, kan drie keer worden herhaald en is optimaal om een hoge hoeveelheid gezuiverde OLs te verkrijgen, zoals cellen gekweekt in Bottenstein-Sato (BS) medium met PDGFα vermenigvuldigen. Gliacellen worden bereid met behul…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen Rémi Ronzano bedanken voor zijn wijze advies in de handschriftredactie. Dit werk werd gefinancierd door ICM, INSERM, ARSEP foundation grant aan NSF en Bouvet-Labruyère prijs.
Materials
| 5-fluorodeoxyuridine | Sigma | F0503 | |
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8769 | |
| DNase (Deoxyribonuclease I) | Worthington | LS002139 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Ethanol 100% | Sigma | 32221-M | |
| Ethanol 70% | VWR Chemicals | 83801.360 | |
| Fetal Calf Serum | ThermoFisher | 10082147 | |
| L-cysteine | Sigma | C7352 | |
| Neurobasal | ThermoFisher | 21103049 | |
| Papain | Worthington | LS003126 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium | ThermoFisher | A1285601 | |
| Polyethylenimine(PEI) | Sigma | P3143 | |
| Tetraborate decahydrate | Sigma | B9876 | |
| Trypsin | Sigma | Sigma | |
| Uridine | Sigma | U3750 | |
| Bottenstein-Sato (BS) media | |||
| apo-Transferrin human | Sigma | T1147 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | A4161 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| PDGF | Peprotech | AF-100-13A | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt) | Sigma | T6397 | |
| T4 (L-Thyroxine) | Sigma | T1775 | |
| Co-culture media | |||
| apo-Transferrin human | Sigma | T1147 | |
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| Biotin | Sigma | B4639 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | A4161 | |
| Ceruloplasmin | Sigma | 239799 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A8199 | |
| Neurobasal | ThermoFisher | 21103049 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescin | Sigma | P5780 | |
| Recombinant Human CNTF | Sigma | 450-13 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt) | Sigma | T6397 | |
| Vitamin B12 | Sigma | V6629 | |
| Tools | |||
| 0.22 µm filter | Sartorius | 514-7010 | |
| 1 mL syringe | Terumo | 1611127 | |
| 100 mm Petri dish | Dutscher | 193100 | |
| 15 mL tube | Corning Life Science | 734-1867 | |
| 50 mL tube | Corning Life Science | 734-1869 | |
| 60 mm Petri dish | Dutscher | 067003 | |
| 70 µm filter | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
| Binocular microscope | Olympus | SZX7 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Large surgical scissors | Fine Science Tools | 14008-14 | |
| Scalpel | Swann-morton | 233-5528 | |
| Shaker | Infors HT | ||
| Small surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Small surgical spoon | Bar Naor Ltd | BN2706 | |
| T150 cm2 flask with filter cap | Dutscher | 190151 | |
| Animal | |||
| P2 Wistar rat | Janvier | RjHAn:WI |
References
- Zalc, B. The acquisition of myelin: a success story. Novartis Foundation Symposium. 276, 15-21 (2006).
- Habermacher, C., Angulo, M. C., Benamer, N. Glutamate versus GABA in neuron-oligodendroglia communication. Glia. 67 (11), 2092-2106 (2019).
- Sherman, D. L., Brophy, P. J. Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth. Nature Reviews. Neuroscience. 6 (9), 683-690 (2005).
- Freeman, S. A., Desmazières, A., Fricker, D., Lubetzki, C., Sol-Foulon, N. Mechanisms of sodium channel clustering and its influence on axonal impulse conduction. Cellular and molecular life sciences: CMLS. 73 (4), 723-735 (2016).
- Lee, Y., et al. Oligodendroglia metabolically support axons and contribute to neurodegeneration. Nature. 487 (7408), 443-448 (2012).
- Nave, K. A. Myelination and the trophic support of long axons. Nature Reviews. Neuroscience. 11 (4), 275-283 (2010).
- Monje, M. Myelin Plasticity and Nervous System Function. Annual Review of Neuroscience. 41, 61-76 (2018).
- Birey, F., et al. Genetic and Stress-Induced Loss of NG2 Glia Triggers Emergence of Depressive-like Behaviors through Reduced Secretion of FGF2. Neuron. 88 (5), 941-956 (2015).
- Frühbeis, C., et al. Neurotransmitter-triggered transfer of exosomes mediates oligodendrocyte-neuron communication. PLoS Biology. 11 (7), e1001604 (2013).
- Jang, M., Gould, E., Xu, J., Kim, E. J., Kim, J. H. Oligodendrocytes regulate presynaptic properties and neurotransmission through BDNF signaling in the mouse brainstem. eLife. 8, (2019).
- Sakry, D., et al. Oligodendrocyte precursor cells modulate the neuronal network by activity-dependent ectodomain cleavage of glial NG2. PLoS Biology. 12 (11), e1001993 (2014).
- Sakry, D., Yigit, H., Dimou, L., Trotter, J. Oligodendrocyte precursor cells synthesize neuromodulatory factors. PloS One. 10 (5), e0127222 (2015).
- Stadelmann, C., Timmler, S., Barrantes-Freer, A., Simons, M. Myelin in the Central Nervous System: Structure, Function, and Pathology. Physiological Reviews. 99 (3), 1381-1431 (2019).
- Freeman, S. A., et al. Acceleration of conduction velocity linked to clustering of nodal components precedes myelination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), E321-E328 (2015).
- Baumann, N., Pham-Dinh, D. Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system. Physiological Reviews. 81 (2), 871-927 (2001).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. The Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).
- Dean, J. M., et al. Strain-specific differences in perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human. Developmental Neuroscience. 33 (3-4), 251-260 (2011).
- Domingues, H. S., Portugal, C. C., Socodato, R., Relvas, J. B., Astrocyte, Oligodendrocyte, Astrocyte, and Microglia Crosstalk in Myelin Development, Damage, and Repair. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 71 (2016).
- Klinghoffer, R. A., Hamilton, T. G., Hoch, R., Soriano, P. An allelic series at the PDGFalphaR locus indicates unequal contributions of distinct signaling pathways during development. Developmental Cell. 2 (1), 103-113 (2002).
- Spassky, N., et al. The early steps of oligodendrogenesis: insights from the study of the plp lineage in the brain of chicks and rodents. Developmental Neuroscience. 23 (4-5), 318-326 (2001).
- Moyon, S., et al. Demyelination Causes Adult CNS Progenitors to Revert to an Immature State and Express Immune Cues That Support Their Migration. Journal of Neuroscience. 35 (1), 4-20 (2015).
- Gardner, A., Jukkola, P., Gu, C. Myelination of rodent hippocampal neurons in culture. Nature Protocols. 7 (10), 1774-1782 (2012).
- Thetiot, M., et al. An alternative mechanism of early nodal clustering and myelination onset in GABAergic neurons of the central nervous system. bioRxiv. , 763573 (2019).
- Dubessy, A. L., et al. Role of a Contactin multi-molecular complex secreted by oligodendrocytes in nodal protein clustering in the CNS. Glia. 67 (12), 2248-2263 (2019).
- Barateiro, A., Fernandes, A. Temporal oligodendrocyte lineage progression: in vitro models of proliferation, differentiation and myelination. Biochimica Et Biophysica Acta. 1843 (9), 1917-1929 (2014).
- Thetiot, M., Ronzano, R., Aigrot, M. S., Lubetzki, C., Desmazières, A. Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (145), (2019).
- Mannioui, A., Zalc, B. Conditional Demyelination and Remyelination in a Transgenic Xenopus laevis. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1936, 239-248 (2019).
