共同培養実験のためのオリゴデンドロサイト及びオリゴデンドロサイト条件培地の生成
Summary
本明細書では、共培養実験に使用できるオリゴデンドロサイトの精製およびオリゴデンドロサイト条件培地の製造のための効率的な方法を示す。
Abstract
中枢神経系では、オリゴデンドロサイトは軸索髄鞘の役割でよく知られており、塩基伝導を通じて作用電位の伝播を促進する。さらに、オリゴデンドロサイトが髄鞘を越えて、特に可溶性因子の分泌を通じてニューロンと相互作用することを示唆する報告が増えている。ここでは、アストロサイトやミクログリア細胞も含むグリア細胞培養物からオリゴデンドロイアル系統細胞を精製できる詳細なプロトコルを紹介する。この方法は、37°Cでの一晩の揺れに依存しており、上にあるオリゴデンドロア細胞とミクログリア細胞の選択的剥離、および微分接着によるミクログリアの排除を可能にする。次に、オリゴデンドロサイトの培養とオリゴデンドロサイトコンディショ化物(OCM)の生成について説明する。また、共同培養実験で精製された海馬ニューロンに加えてOCM治療またはオリゴデンドロサイトの動態を提供し、オリゴデンドロサイトとニューロンの相互作用を研究する。
Introduction
オリゴデンドロサイト(OLs)は、軸索の周りにミエリンを包む中枢神経系(CNS)のグリア細胞です。OLsは、オリゴデンドロビ細胞前駆体細胞(OPC)に由来し、胚性CNSの心室領域内で増殖し、完全に成熟したOL(すなわちミエリン形成細胞)1に移行して分化する。初期の発達中には多くのオペックが豊富であるが、成人の脳にも持続し、そこで主要な増殖細胞集団2を表す。単一のOLは、非興奮性セクション(すなわち、ノード間)で複数の軸索を包み込み、各ミエリンループの端は、ミエリン1、3の絶縁特性にとって重要である副線ドメインを形成する軸索に付着する。パラノードの間には、ランヴィエのノードと呼ばれる小さな髄を持たしない隙間があります。これらのノードは電圧ゲート付きナトリウムチャネル(Nav)が豊富で、塩基伝導4を介した作用電位の再生と急速な伝播を可能にする。この緊密な相互作用はまた、AL5、6からの乳酸の神経の取り込みを通じて軸索エネルギーサポートを可能にする。
オリゴデンドログリア系統細胞の成熟と髄鞘形成プロセスは、ニューロン7との相互作用によって厳しく調節される。実際、NG2細胞とも呼ばれるOLsおよびOPCは、神経伝達物質の受容体の配列を発現し、興奮性および抑制性ニューロンからの入力を受け取ることができ、ミエリネーション細胞への増殖および/または分化を引き起こす可能性のあるニューロン活性を感知することができる2。次に、OPC/ORLsは、単独または相乗的に神経調節および神経保護機能8、9、10、11、12を仲介する細胞外空間に微小胞およびタンパク質を分泌する。しかし、オリゴデンドロアリエンス系統細胞とニューロンとの間の相互作用の複数のモードを制御する分子メカニズムはまだ完全に解読されていません。
さらに、いくつかのCNS病理学的状態では、OLsは主に影響を受け、ニューロンとの相互作用を妨げる。例えば、多発性硬化症(MS)では、神経機能障害は、CNSの焦点脱髄によって引き起こされ、軸索損傷および関連する障害蓄積につながる可能性のあるAL喪失に二次的である。ほとんどの場合、13が不十分ですが、再髄鞘化が行われる可能性があります。過去10年間の進歩は、免疫療法の発達のために、再発率を低下させたが、再髄鞘化を促進することは、満たされていないニーズに残っている。そのため、幅広いCNS条件に対する新しい治療法の開発に特に関心のある、ロール、機能、影響についての理解が深まります。
ここでは、OLsの精製と培養の方法について説明します。これにより、その開発と生物学を調節する本質的なメカニズムを正確に調べられます。さらに、このような高度に富んだOLs培養は、オリゴデンドロサイトコンディショナリ培地(OCM)の産生を可能にし、精製ニューロン培養物に加えて、OLs分泌因子が神経細胞生理学および接続性に及ぼす影響を洞察することができる。さらに、精製されたオリゴデンドロサイトとニューロンを組み合わせて、髄鞘形成(re)形成を調節するメカニズムに対処できるインビトロ共培養システムを実装する方法について説明する。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、混合グリア培養物から高度に濃縮されたオリゴデンドログリア系細胞培養物を得るための詳細なプロトコルを提供し、先に公表した方法16から適応し、その後のOL条件培地の製造を行う。この振れ技術は高価ではないが、3回繰り返し、また、PDGFαを含むボッテンシュタイン・サト(BS)培地で培養した細胞が増殖するように、高量の精製オールを得るのに最適である?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、レミ・ロンツァーノの原稿編集における賢明なアドバイスに感謝したいと思います。この作品は、ICM、INSERM、NSFへのARSEP財団助成金、ブーヴェ・ラブリュイエールの価格によって資金提供されました。
Materials
| 5-fluorodeoxyuridine | Sigma | F0503 | |
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8769 | |
| DNase (Deoxyribonuclease I) | Worthington | LS002139 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Ethanol 100% | Sigma | 32221-M | |
| Ethanol 70% | VWR Chemicals | 83801.360 | |
| Fetal Calf Serum | ThermoFisher | 10082147 | |
| L-cysteine | Sigma | C7352 | |
| Neurobasal | ThermoFisher | 21103049 | |
| Papain | Worthington | LS003126 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium | ThermoFisher | A1285601 | |
| Polyethylenimine(PEI) | Sigma | P3143 | |
| Tetraborate decahydrate | Sigma | B9876 | |
| Trypsin | Sigma | Sigma | |
| Uridine | Sigma | U3750 | |
| Bottenstein-Sato (BS) media | |||
| apo-Transferrin human | Sigma | T1147 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | A4161 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| PDGF | Peprotech | AF-100-13A | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt) | Sigma | T6397 | |
| T4 (L-Thyroxine) | Sigma | T1775 | |
| Co-culture media | |||
| apo-Transferrin human | Sigma | T1147 | |
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| Biotin | Sigma | B4639 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | A4161 | |
| Ceruloplasmin | Sigma | 239799 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A8199 | |
| Neurobasal | ThermoFisher | 21103049 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescin | Sigma | P5780 | |
| Recombinant Human CNTF | Sigma | 450-13 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt) | Sigma | T6397 | |
| Vitamin B12 | Sigma | V6629 | |
| Tools | |||
| 0.22 µm filter | Sartorius | 514-7010 | |
| 1 mL syringe | Terumo | 1611127 | |
| 100 mm Petri dish | Dutscher | 193100 | |
| 15 mL tube | Corning Life Science | 734-1867 | |
| 50 mL tube | Corning Life Science | 734-1869 | |
| 60 mm Petri dish | Dutscher | 067003 | |
| 70 µm filter | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
| Binocular microscope | Olympus | SZX7 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Large surgical scissors | Fine Science Tools | 14008-14 | |
| Scalpel | Swann-morton | 233-5528 | |
| Shaker | Infors HT | ||
| Small surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Small surgical spoon | Bar Naor Ltd | BN2706 | |
| T150 cm2 flask with filter cap | Dutscher | 190151 | |
| Animal | |||
| P2 Wistar rat | Janvier | RjHAn:WI |
References
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